Yeasen/翌圣生物 品牌
生产厂家厂商性质
上海市所在地
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 目录价(元) |
Puromycin (Solution 10 mg/mL) 嘌呤霉素盐酸盐溶液 | 60209ES60 | 10×1 mL | 1588 |
60209ES76 | 50×1 mL | 7985 | |
60209ES77 | 1×50 mL | 7385 |
产品描述
嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素,通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌,各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3´末端的类似物,能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后,不会参与随后的任何反应,从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC),赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。
嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关,现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。在某些特定情况下,嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。
本品是无菌的嘌呤霉素盐酸盐溶液(10 mg/mL in 20mM HEPES缓冲液,pH 6.2-6.8)。
产品性质
CAS 号(CAS NO.) | 58-58-2 |
分子式(Formula) | C22H29N7O5·2HCl |
分子量(Molecular weight) | 544.43 g/moL |
纯度(Purity, HPLC) | >98% |
浓度(concentration) | 10 mg/mL |
结构式(Structure) |
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃保存,1年有效期。
使用方法
1. 建议使用浓度
哺乳动物细胞:1-10 μg/mL,佳浓度需要杀灭曲线来确定。
大肠杆菌:LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌,使用浓度为125 μg/mL。
【注】:使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节,而且受宿主细胞本身的影响。
2. 溶解方法
用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/mL的母液,经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存;也可溶于甲醇,配制成10 mg/mL 的储存液。
3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定(以shRNA转染或者慢病毒转导为例)
嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的 shRNA 细胞株,确定杀死未转染/转导细胞的低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线(kill curve)。
1)Day 1:24孔板内以5~8×104 cells/孔的密度铺板,铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜。
2)Day 2:①准备筛选培养基:含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如 0-15 μg/mL,至少 5 个梯度);②往孵育过夜后的细胞内更换新鲜配制的筛选培养基;之后37℃孵育细胞。
3)Day 4:更换新鲜的筛选培养基,并观察细胞存活率。
4)根据细胞的生长状态,约2-3天更换新鲜的筛选培养基。
5)每日监测细胞,观察存活细胞率,从而确定抗生素筛选开始 4-6 天内有效杀死非转染或所有非转导细胞的药物低浓度。
4. 哺乳动物稳定转染细胞株的筛选
等转染含有pac基因的质粒后,细胞在含有嘌呤霉素的培养基中增殖,以筛选出稳定转染子。
1)细胞转染 48 h 后,将细胞(原样或稀释)置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养。
【注】:当细胞处于分裂活跃期时,抗生素作用明显。细胞过于密集,抗生素产生的效力会明显下降。好进行细胞分盘使其密度不超过25%。
2)每隔2-3天,移除和更换含有嘌呤霉素的培养基。
3)筛选7天后评估细胞形成的病灶。病灶可能需要额外的一周或者更多时间,这依赖于宿主细胞系和转染筛选效率。
【注】:每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要 48 h,有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3-10天。
4)转移和放置5-10个抗性克隆到一个35 mm的培养皿中,用选择培养基继续培养7天。此次富集培养是为日后的细胞毒性实验做准备。
注意事项
1.嘌呤霉素为有毒化合物,操作时请小心拿放。
2.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
3.本产品仅作科研用途!
HB220329