Yeasen/翌圣生物 品牌
生产厂家厂商性质
上海市所在地
产品简介
GSTSep Glutathione Agarose Resin是一种GST标签蛋白纯化树脂，结构上以6%交联的琼脂糖凝胶为基质，通过12个原子的间隔臂，用化学方法共价结合还原型制作而成。该设计使树脂的纯化效率得到了较大提高，使其每毫升基质可承载>20 mg GST融合蛋白。
此外，本品特异性好，性价比高，可以一步纯化各种表达系统中-S-转移酶、依赖性蛋白和重组衍生物。
产品信息
货号 | 20507ES10/20507ES50/20507ES60/20507ES80 |
规格 | 10 mL /50 mL /100 mL/1000 mL |
产品性质
基质（Matrix） | 6%交联的琼脂糖微球 |
配体（Ligand） | 通过12原子间隔臂偶联的 |
粒径（Bead size） | 45-165 µm |
载量（Capacity） | >20 mg GST蛋白（40 kDa）/mL基质 |
最大压力（PressureMax） | 0.1 MPa，1 bar |
pH稳定范围（pH range） | 3-12 |
储存缓冲液（Buffer） | 含20%乙醇的1×PBS |
储存条件
2~8℃保存，有效期2年。
需准备试剂
所用水和Buffer在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤除菌。
平衡/洗杂缓冲液：140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4
洗脱缓冲液：用平衡液配制10 mM 还原型（现配现用）
【注】平衡/洗杂缓冲液或洗脱缓冲液中可加入1-10 mM DTT。
使用说明
【注】样品在上样前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤，减少杂质以防阻塞柱子。
1. 样品纯化
1）装柱：将GSTSep Glutathione Agarose Resin装入合适的层析柱，注意避免产生气泡。
2）平衡：用5倍柱体积的平衡Buffer平衡柱子，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。
3）上样：Resin平衡后，加入蛋白样品，使其与Resin充分接触，提高目的蛋白回收率，收集流出液。
4）洗杂：用10-15倍柱体积的洗杂缓冲液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
5）洗脱：使用5-10倍柱体积的洗脱缓冲液，收集洗脱液，即目的蛋白溶液。
6）清洗与保存：依次使用3倍柱体积的平衡Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。
2. SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。
3. 填料清洗
GST标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异结合蛋白的增多和蛋白的聚集，会造成流速和结合载量性能下降，此时需对填料进行清洗。
1）去除一些沉淀或变形物质
用2倍柱体积的6 M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH 7.4清洗。
2）去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH 7.4清洗。
注意事项
1.请勿冷冻保存本产品。
2.GSTSep Glutathione Agarose Resin使用前一定要充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。
3.所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。
4.本产品仅作科研用途。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
附表 问题及解决方案
问题 | 可能原因 | 推荐解决方案 |
柱子反压过高 | 填料被堵塞 | 清洗树脂 |
裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上样前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤，或离心去除 | ||
样品太黏稠 | 样品中含高浓度的核酸，延长破碎时间直至粘度降低，或添加DNaseI （终浓度为5 µg/mL），Mg2+（终浓度1 mM），冰上孵育10-15 min | |
缓冲液太黏稠 | 有机试剂或蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速 | |
洗脱组分中无目的蛋白 | GST标签蛋白变性了 | 使用温和的裂解条件，实验条件以经验为准 |
过度的裂解使目的蛋白变性 | ||
目的蛋白聚集产生沉淀 | 在细胞裂解前溶液中加入DTT，终浓度为1-10 mM | |
融合蛋白改变了GST的构象，影响了目的蛋白的结合力 | 测定pGEX中GST的结合力，对载体进行超声处理，检测其结合力。如果载体中GST有很高的亲和力，有可能是改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和力 | |
降低结合温度至4℃，充分清洗 | ||
柱子平衡时间太短，目的蛋白不是在pH 6.5-pH 8.0范围内结合 | 用pH 6.5-pH 8.0的buffer进行充分的平衡，如PBS | |
目的蛋白没有洗脱下来 | 洗脱体积太少 | 增加洗脱液体积，减小洗脱流速。 |
洗脱液中浓度太低 | 增加洗脱液中还原型浓度，可尝试用20-40 mM还原型洗脱。 | |
低pH影响洗脱 | 在不增加洗脱液中量时，提高洗脱液中pH至pH 8-9会有改善 | |
增加洗脱液中离子强度，如0.1-0.2 M NaCl | ||
洗脱液中被氧化 | 使用新鲜配制的洗脱液 | |
加入DTT | ||
非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解和洗脱 | 洗脱液中加入非离子型洗涤剂，如0.1%的Triton X-100或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20 | |
电泳或Western Blot检测中发现多条带 | Mr 70000蛋白与目的蛋白一起纯化下来 | Mr 70000蛋白可能是大肠杆菌基因DnaK的产物，可以在目的蛋白中加入50 mM Tris-HCl，2 mM ATP，10 mM MgSO4，pH 7.4在37℃加热10min去除 |
可通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的dnaK蛋白 | ||
GST融合蛋白已经发生降解 | 在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如加入1 mM PMSF | |
可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的，可使用蛋白酶缺陷型宿主菌（如lon-或ompT） | ||
细胞破碎过度 | 减少细胞破碎时间，超声前加入溶（菌液体积的0.1倍10 mg/mL溶菌，25 mM Tris-HCl，pH 8.0），避免发泡导致蛋白酶变性，过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白的共纯化。 | |
共价共纯化 | 包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化，如：DnaK（Mr～70000），DnaJ（Mr～37000），GrpE（Mr～40000），GroEL（Mr～57000），GroES（Mr～10000） | |
抗体与E. coli的各种蛋 白反应 | 抗体吸附E. coli蛋白：GST-抗体；超声处理去除GST抗体，可以用Western Blot检测 |
