镍-琼脂糖凝胶6FF（Ni-NTA Resin）

Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF是用于纯化6×His标签重组蛋白的一种纯化介质，它是由6%交联的Sepharose耦连了一种四齿螯合剂NTA而得. 它可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的6×His标签重组蛋白。NTA，含有四个螯合区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+。6×His可与Ni2+螯合，从而使His标签蛋白结合在Ni-NTA纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液的温和洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。该纯化介质与His标签蛋白具有*的亲和力，可达5-20 mg/ml。可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的His标签蛋白。纯化程序简单，所得的蛋白纯度可高达95％。Ni-NTA可再生4-6次，重复使用。本产品悬浮液为20％乙醇，已螯合Ni2+。

操作方法：

A. 非变性条件下抽提His标签蛋白

1) 准备细胞，接种，诱导表达。收集细胞，置于-70°C或立即进行步骤2操作。

2) 加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作浓度为1 mM现用现加。

3) 将细胞悬浮起来，加入溶菌酶，混匀，冰上放置30分钟，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。

4) 加入10% Triton X-100, 使终浓度为0.05%，充分混匀，冰上放置15分钟。

5) 12000 rpm/min(20,000×g以上)，4°C离心15分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20°C保存。

6) 将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗。

7) 将样品加NTA层析柱中，流速在15 ml/h左右，收集穿透部分，用SDS/PAGE分析蛋白的结合情况。

8) 层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30 ml/h左右。

9) 分别用5倍NTA体积的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗脱，流速控制在15 ml/h左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。

10) 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。为有效的方式是SDS-PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。

11)纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。 NTA-0 、20、40、60、80、100、200、1000Buffer分别为浓度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol，添加0、20、40、60、80、100、200、1000 mM Imidazole。

B.变性条件下从包涵体中纯化His标签蛋白

1) 准备细胞，接种，诱导表达。收集细胞，置于-70°C或立即进行步骤2操作。

2) 加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作浓度为1 mM现用现加。

3) 将细胞悬浮起来，冰上超声破碎细胞，降低粘稠度。

4) 室温放置30分钟，间或混匀或用磁力搅拌。

5) 12000转/分（20,000×g以上），4°C离心15分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20°C保存。

6) 将NTA树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗。

7) 将样品加到NTA层析柱中，流速控制在15 ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。

8) 层析用5倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30 ml/h左右。

9) 分别用5倍NTA体积GuNTA-20、GuNTA-40，GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500洗脱，流速在15 ml/ h左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。

10) 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。为有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。

11) 目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。

12) 纯化的目标蛋白质需要复性，复性常用的手段可以参考有关手册确定的原则。

GuNTA-0 、20、40、60、100、500Buffer分别为浓度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,6 M Guanidium HCl添加0、20、40、60、100、500 mM Imidazole。

C. NTA树脂的再生

NTA树脂在使用若干次数（3-5次）后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效率。

NTA树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液，估计出NTA的树脂体积，按下列次序将再生试剂加到层析柱里，在等上一步再生溶液流干后，再加下一步再生溶解。

用户需要自行准备25%、50%、75%、100%（v/v）乙醇和去离子水。 从层析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA树脂体积的Stripping Solution I、2倍体积的去离子水、3倍体积的Stripping Solution II、1倍体积的25%乙醇、1倍体积的50%乙醇、1倍体积的75%乙醇、5倍体积的100%乙醇、1倍体积的75%乙醇、1倍体积的50%乙醇、1倍体积的25%乙醇、1倍体积的去离子水、5倍体积的Stripping Solution III、3倍体积的去离子水分别洗一遍。

如果立即使用，用5倍体积的Ni Charging Solution洗，再用10倍体积的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗；如果想长期储存，加入1倍体积的20%乙醇，4°C保存，使用前用5倍体积的Ni Charging Solution洗，再用10倍体积的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗

再生溶液配方：Stripping Solution I:  6M GuHCl, 0.2M acetic acid。Stripping Solution II: 2% SDS。        Stripping Solution III: 100 mM EDTA, pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4

镍-琼脂糖凝胶6FF（Ni-NTA Resin）