蛋白质纯化试剂 镍-琼脂糖凝胶 6FF（HIS 标签纯化树脂）
货号：P2010
规格：5ml/ 10ml（凝胶体积）
保存 ：4°C 保存，有效期少一年

产品说明：
    Ni-NTA琼脂糖凝胶 6FF是用于纯化 6×His标签重组蛋白的一种纯化介质，它是由 6%交联的Sepharose耦连了一种四齿螯合剂NTA而得. 它可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的 6×His标签重组蛋白。
    NTA，含有四个螯合区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni 2+ 。6×His可与Ni 2+ 螯合，从而使His标签蛋白结合在Ni-NTA纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液的温和洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。该纯化介质与His标签蛋白具有的亲和力，可达 5-20 mg/ml。
    可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的His标签蛋白。纯化程序简单，所得的蛋白纯度可高达 95％。
    Ni-NTA可再生 4-6 次，重复使用。本产品悬浮液为 20％乙醇，已螯合Ni 2+ 。

操作方法：
A.  非变性条件下抽提 His  标签蛋白
     1) 准备细胞，接种，诱导表达。收集细胞，置于-70°C 或立即进行步骤 2 操作。
     2) 加入 1/20 细胞生长体积的 NTA-0 Buffer 和 PMSF。PMSF 使用的工作浓度为 1 mM 现用现加。
     3) 将细胞悬浮起来，加入溶菌酶，混匀，冰上放置 30 分钟，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。
     4) 加入 10% Triton X-100, 使终浓度为 0.05%，充分混匀，冰上放置 15 分钟。
     5) 12000 rpm/min(20,000×g 以上)，4°C 离心 15 分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20°C 保存。
     6) 将 NTA 树脂装入合适的层析柱，层析用 10 倍 NTA 体积的 NTA-0 Buffer 洗。
     7) 将样品加 NTA 层析柱中，流速在 15 ml/h 左右，收集穿透部分，用 SDS/PAGE 分析蛋白的结合情况。
     8) 层析用 5 倍 NTA 体积的 NTA-0 Buffer 洗，流速控制在 30 ml/h 左右。
     9) 分别用 5 倍 NTA 体积的 NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗脱，流速控制在 15 ml/h 左右，收集洗脱液，每管收集一个 NTA 体积。
    10) 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。 为有效的方式是 SDS-PAGE 分析。 也可以用 Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白质的分布。
    11)纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。
NTA-0 、 20、 40、 60、 80、 100、 200、 1000Buffer 分别为浓度 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol，添加 0、20、40、60、80、100、200、1000 mM Imidazole。
B. 变性条件下从包涵体中纯化 His  标签蛋白
    1) 准备细胞，接种，诱导表达。收集细胞，置于-70°C 或立即进行步骤 2 操作。
    2) 加入 1/20 细胞生长体积的 GuNTA-0 Buffer 和 PMSF。PMSF 使用的工作浓度为 1 mM 现用现加。
    3) 将细胞悬浮起来，冰上超声破碎细胞，降低粘稠度。
    4) 室温放置 30 分钟，间或混匀或用磁力搅拌。
    5) 12000 转/分（20,000×g 以上），4°C 离心 15 分钟以上。取上清，置于冰上备用或-20°C 保存。

    6) 将 NTA 树脂装入合适的层析柱，层析用 10 倍 NTA 体积的 GuNTA-0 Buffer 洗。
    7) 将样品加到 NTA 层析柱中，流速控制在 15 ml/h 左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况。
    8) 层析用 5 倍 NTA 体积的 GuNTA-0 Buffer 洗，流速控制在 30 ml/h 左右。
    9) 分别用 5 倍 NTA 体积 GuNTA-20、GuNTA-40，GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500 洗脱，流速在15 ml/ h 左右，收集洗脱液，每管收集一个 NTA 体积。
    10) 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。 为有效的方式是 SDS/PAGE 分析。 也可以用 Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白质的分布。
   11) 目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。
   12) 纯化的目标蛋白质需要复性，复性常用的手段可以参考有关手册确定的原则。
GuNTA-0 、20、40、60、100、500Buffer 分别为浓度 20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,6 M
Guanidium HCl 添加 0、20、40、60、100、500 mM Imidazole。
C. NTA  树脂的再生
    NTA 树脂在使用若干次数（3-5 次）后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效率。NTA 树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液，估计出 NTA 的树脂体积，按下列次序将再生试剂加到层析柱里， 在等上一步再生溶液流干后， 再加下一步再生溶解。 用户需要自行准备 25%、 50%、75%、100%（v/v）乙醇和去离子水。
从层析柱下端流干所有溶液，用 2 倍 NTA 树脂体积的 Stripping Solution I、2 倍体积的去离子水、3 倍体积的 Stripping Solution II、1 倍体积的 25%乙醇、1 倍体积的 50%乙醇、1 倍体积的 75%乙醇、5 倍体积的 100%乙醇、 1 倍体积的 75%乙醇、 1 倍体积的 50%乙醇、 1 倍体积的 25%乙醇、 1 倍体积的去离子水、 5 倍体积的 StrippingSolution III、3 倍体积的去离子水分别洗一遍。
如果立即使用， 用 5 倍体积的 Ni Charging Solution 洗， 再用 10 倍体积的平衡溶液 （NTA-0Buffer 或 GuNTA-0Buffer）洗；如果想长期储存，加入 1 倍体积的 20%乙醇，4°C 保存，使用前用 5 倍体积的 Ni Charging Solution洗，再用 10 倍体积的平衡溶液（NTA-0Buffer 或 GuNTA-0 Buffer）洗再生溶液配方：Stripping Solution I: 6M GuHCl, 0.2M acetic acid。Stripping Solution II: 2% SDS。
Stripping Solution III: 100 mM EDTA, pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4

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