乙酰辅酶A羧化酶试剂盒 微量法

样本的前处理

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长 660nm，蒸馏水调零。

2、 酶促反应试剂的配制和预热：在试剂二瓶中加入 2.5mL 试剂一，充分溶解混匀；在试剂三瓶中加入 2mL 蒸馏水，充分溶解混匀；将试剂一、二、三在 37℃(哺乳动物)或 25℃ (其它物种)预热 10 分钟。

3、定磷试剂的配制：按 H2O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂 应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。注意：配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

4、0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂七 20 倍稀释，即取 0.5mL 试剂七加 9.5 蒸馏水，充分混匀。

乙酰辅酶A羧化酶试剂盒 微量法

ACC 活性计算： 1、按组织蛋白浓度计算：定义：每小时每毫克组织蛋白产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。 ACC (μmol/h/mg prot)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷ (V 样×Cpr)÷T=10×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr 2、按样本鲜重计算：定义：每小时每 g 组织产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。 ACC (μmol/h /g 鲜重)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管）×V 总÷ (W× V 样÷V 样总)÷T=10×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W 3、 按细菌或细胞密度计算：定义：每小时每 500 万细菌或细胞产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。 ACC (U/104 cell)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管）×V 总÷ (500× V 样÷V 样总)÷T=0.02×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管) C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.1mL；V 样：加入样本体积，0.01mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5 小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

ACC 能够催化乙酰辅酶 A、NaHCO3和 ATP 生成丙二酰辅酶 A、ATP 和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定 ACC 活性。