无荧光性新型SHG成像用染料

Ap3, SHG成像染料

Ap3是一种无荧光性SHG染料，在SHG信号成像中不会发出障碍性荧光。它与常规的荧光性膜染色染料不同，可以只观察细胞膜的信号，因此能够用于分析细胞膜的准确位置。另外，由于SHG信号强度和膜电位相关，因此还能用于膜电位的成像。

※ 本产品仅供科研用，不可作其他用途。

※ 本产品基于庆应义塾大学 医学部药理学教室以及筑波大学 数理物质系（学际物质科学研究中心）的研究成果，由funakoshi进行商品化并销售。

※ Nuriya M., et al, Nat. Commun., 7:11557 (2016).

※ 庆应义塾大学医学部 药理学教室 塗谷老师的相关采访文章，请复制链接访问 https://www.funakoshi.co.jp/contents/65872。

使用SHG专用染料对细胞膜现象进行成像

利用双光子现象之二次谐波产生（Second Harmonic Generation: SHG）

在显微镜下测量细胞膜形态和变化

庆应义塾大学 医学部药理学教室 塗谷睦生 老师

【背景】

细胞膜分隔细胞内外，可以作为在其周边产生的电信号和化学信息的传递场所，因此在细胞间和细胞内的信息传递中起着十分重要的作用。但是，由于其结构的精细和复杂性等，难以进行生理学上的分析。研究发现，对细胞膜具有高亲和力的染料在细胞膜中会发出强烈的SHG信号，由于该信号会根据膜电位而变化，因此研究认为，SHG成像在细胞膜的标记及其电位变化的分析等方面非常有效。

【无荧光性SHG专用染料Ap3】

Ap3是为了SHG成像而开发和合成的一种新型的无荧光性SHG专用染料，使用这种染料可实现观察其他荧光染料的同时观测。利用这一点，使用Ap3进行SHG成像可以观察到响应神经活动引起的膜电位变化，同时通过钙敏感性染料的荧光成像，还可以观察到膜附近钙浓度的变化。研究表明，使用Ap3进行的成像，由于光照射引起的信号衰减和细胞毒性非常低。因此利用Ap3能够可视化细胞膜，捕捉膜电位的变化，还可能同时对荧光蛋白的动态和报告荧光染料的信号变化进行长时间成像。因而使用Ap3对脑细胞、包括肌细胞在内的其他兴奋性细胞的生理学分析，或使用各种系统的离子通道的功能分析等的应用方面备受期待。

【展望】

除上述以外，SHG成像还可以对细胞膜的损伤和脂质成分，以及核酸或蛋白等生物分子的结构变化等多种生命现象进行高灵敏度检测。利用具有这种特殊能力的普通多光子显微镜系统，即可轻松地进行SHG成像，而且通过扩展专用染料的应用性，相信SHG成像作为生命科学领域研究中的新型工具会有更进一步的发展。

◆特点

●　Ap3是SHG成像的专用染料。除 SHG信号外，不会发出荧光

●　Ap3无荧光性， SHG成像的同时还能进行钙成像等荧光性成像的多模式成像

●　Ap3是一种光稳定性高的化合物

●　Ap3具有极低的光毒性，对细胞的损伤小

●　推荐光源：钛蓝宝石激光（波长标准：950 nm）

※ 在SHG成像中，需要双光子激发显微镜、SHG信号用滤光片（例如465-485 nm的带通滤光片）

※ 在SHG成像的观察中，物镜的另一侧（正置显微镜时为下方）需要检测系统。另外，在检测系统一侧建议使用具有光电倍增管（PMT）的显微镜。

◆操作方法要点

1. 在玻璃底培养皿中培养细胞；

2. 向细胞中添加终浓度为20 μM的Ap3溶液；

3. 使用双光子激发显微镜进行观察。

◆应用实例1

■　Ap3的SHG信号和无荧光性

950 nm激光照射时，通过Ap3可观察到 SHG 信号，但未观察到荧光信号。

■　脑切片中SHG成像的膜电位变化

A：电压固定时SHG信号的膜电位敏感性

B：动作电位依赖性SHG信号变化（左）和通过膜片钳测量的电位变化（右）

Nuriya M., et al, Nat. Commun., 7:11557 (2016).

■　同时测量脑切片中SHG成像的膜电位变化和荧光成像的钙浓度

在脑切片中反复施加动作电位时（左；比例尺20 mV，5 s），观察Ap3的SHG信号和荧光性钙检测试剂Rhod-2的双光子荧光信号（TPF）（右）。在成像中同时测量的膜电位变化和钙浓度变化。

Nuriya M., et al, Nat. Commun., 7:11557 (2016).

◆应用实例2

■　比较多模式双光子显微镜下的细胞膜选择性SHG成像和细胞膜荧光成像

用Ap3对表达细胞膜观察用膜锚定GFP的细胞进行染色，同时可视化在950 nm飞秒激光照射下GFP的双光子荧光（TPF，绿色）和Ap3的SHG（洋红色）信号。

由于GFP信号不仅从细胞膜，还会从囊泡等许多细胞内的膜结构中发出强烈的荧光，因此难以准确地识别出细胞膜的位置。与之相对的，Ap3的 SHG 信号只能从细胞膜发出，从而可以实现细胞膜的选择性成像和位点的准确识别。

Mizuguchi T., et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

■　分析多模式双光子显微镜下细胞膜正下方的囊泡动态和肌动蛋白

在表达GFP标记肌动蛋白的细胞中，分别用红色荧光标记Dextran染色胞吞后的囊泡，用Ap3染色细胞膜，同时利用多模式双光子显微镜进行可视化。

Ap3的SHG信号具有细胞膜特异性，而且可以与荧光信号*分离，因此能够通过Ap3的SHG信号准确识别细胞膜的位置，从而准确地测量从细胞膜到肌动蛋白骨架的距离。

Mizuguchi T., et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

■　分析多模式双光子显微镜下质膜正下方的囊泡动态和微管蛋白

在经过微管蛋白可视化试剂染色的细胞中，分别用红色荧光标记Dextran标记胞吞后的囊泡，用Ap3标记细胞膜，利用多模式双光子显微镜进行可视化。

Ap3的SHG信号具有细胞膜特异性，而且可以与荧光信号*分离，因此能够通过Ap3的SHG信号准确识别细胞膜的位置，而且可以测量从细胞膜到微管，以及细胞膜正下方囊泡移动的准确距离。

Mizuguchi T., et al, iScience., Nov 30 ; 9 :359～366 (2018).

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