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转基因大豆MON87705品系试剂盒(荧光-PCR法)
通用名称:转基因大豆 MON87705 品系核酸检测试剂盒 (荧光-PCR 法)
Name :Diagnostic Kit for MON87705 Gene DNA (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
本试剂盒适用于检测转基因植物的 MON87705 基因,用于筛查待检测植物中是否含有 MON87705 成分。其检测结果仅供参考。
【检验原理】
本试剂盒用国家标准的 MON87705 特异性引物和探针,用荧光 PCR 技术进行转基因成分的检测。
【试剂组成】
名 称 | 规 格 |
酶液 | 50μL×1 管 |
MON87705 反应液 | 500μL×2 管 |
MON87705 阳性质控品 | 50μL ×1 管 |
阴性质控品 | 250μL ×1 管 |
说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
-20℃避光保存、运输、避免反复冻融,反复冻融次数不超过 5 次。有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】称取 200g 样品。【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 0℃。
转基因大豆MON87705品系试剂盒(荧光-PCR法)使用方法】
1. 样品处理(样本处理区)
1.1 样本前处理
固体样本:用粉碎机或冷冻研磨仪将样品研磨至细粉状。
对于固体标本,DNA 的提取可以采用 SN/T 2584-2010 中推荐的方法:
1) 每个样品取 2 个平行管。称取 200mg 粉碎的样品,加入 1mL 预冷至 4℃的抽提液,剧烈摇动混匀后,在冰上静止 5min,4℃条件下 10000g 离心 15min,弃上清液;
2) 加入 600μL 预热至 65℃的裂解液,充分重悬沉淀,在 65℃恒温保持 40min, 期间颠倒混匀 5 次;
3) 室温条件下10000g 离心10min,取上清液转移至新离心管中,加入5μLRNAseA, 37℃恒温 30min,分别用等体积苯酚:异戊醇溶液:异戊醇溶液各抽提一次;
4) 室温条件下,10000g 离心 10min,取上清液至新离心管,加入三分之二体积的异丙醇,十分之一体积的 3mol/L 的乙酸钠溶液(pH=6.5),-20℃放置 2-3h;
5) 在 4℃条件下,10000g 离心 15min,弃上清液,用 70%乙醇洗涤沉淀一次,倒出乙醇,晾干沉淀;
6) 加入 50μL TE(pH8.0)溶解沉淀,所得溶解即为样品 DNA 溶液。也可使用等效的 DNA 提取试剂盒。
油脂样本请直接选用市售油脂 DNA 提取试剂盒,按说明操作。
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;样品每满 7 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 | MON87705 反应液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL,加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
1.1 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;荧光通道选择: 检测通道
(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)选择 NONE,请勿选择 ROX 参比荧光。
1.2 推荐循环参数设置:
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
设置 Baseline 和 Threshold:一般直接按机器自动分析的结果分析,当曲线出现整体倾斜时,根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节),以及Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照),重新分析结果。
结果判断
阳性:检测通道 Ct 值≤35,且曲线有明显的指数增长曲线;
可疑:检测通道 35<Ct 值≤38,建议重复检测,如果检测通道仍为 35<Ct 值≤ 38,且曲线有明显的增长曲线,判定为阳性,否则为阴性;
阴性:样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
阴性质控品:Ct>38 或无 Ct 值显示;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数生长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。