3磷酸甘油酸激酶(PGK)测试盒微量法

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商品属性：

测定意义：

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化 1，3-二磷酸甘油酸转变为 3-磷酸甘油酸，产生 1 分子 ATP，具有影响 DNA 复制和修补及刺激病毒 RNA合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。

 测定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 产生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP，1,3-二磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，340nm 处的吸光度变化反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。 

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板。

试剂组成和配制

提取液：液体 100mL×2 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 4 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 酶液提取

①总 PGK 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，500g 离心 5min，取上清测定。

②胞浆和叶绿体 PGK 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液），冰浴匀浆后于 4℃，500g 离心 5min，弃沉淀，取上清在 4℃，8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 PGK 酶活性，取沉淀加 1mL

提取液，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，500g 离心 5min，取上清测定叶绿体中 PGK 酶活性。

建议测定总 PGK 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 PGK，则按照步骤②提取粗酶液。

测定步骤:

1.分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 

2. 取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 100μL 试剂一，20μL 试剂二，10μL 试剂三，10μL 试剂四，40μL 试剂五，20μL 粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2，△A=A1-A2

计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK（nmol/min /g 鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10

3 L / mol /cm；d：比

色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反

应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK（nmol/min /g 鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643.08×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10

3 L / mol /cm；d：比

色皿光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反

应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

生化试剂盒的使用注意事项：

选择合适的试剂盒：根据实验目的和检测对象选择合适的试剂盒，确保实验的准确性和可靠性。

严格遵循说明书：按照试剂盒的说明书进行操作，避免误用或浪费。

注意保存条件：按照试剂盒的保存条件进行妥善保存，避免阳光直射、高温或潮湿等不利因素。

控制实验条件：在实验过程中严格控制实验条件，如温度、时间、pH值等，以确保实验结果的稳定性。

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