小鼠背根神经节细胞

一、细胞基本属性

培养基：MSCM基础培养基：，FBS，Penicillin，Streptomycin等

包被条件：-

传代特性：不建议传代

消化液：0.25%胰dan白酶

培养条件：气相：空气，95%；CO2，5%

细胞简介：小鼠背根神经节细胞分离自脊髓组织；背根神经节（DRG）是周围神经系统的感觉神经元；背根神经节分散存在于PNS，定位于和脊髓紧密相连的脊神经根上，DRG起源于神经嵴，由多潜能前体细胞迁移分化形成。每个神经节主要由感觉神经元和神经纤维构成。神经元周围有卫星细胞，轴突由雪旺细胞包绕形成髓鞘。DRG是外周和中枢纤维联系的一个重要中继站，在神经系统中起着重要作用。DRG神经元直接参与一些遗传性和获得性神经的病理生理。DRGs的体外培养模型已广泛用于轴突的导向及再生、突触发育和可塑性、中枢神经系统和周围神经系统的髓鞘形成，神经营养因子作用及受体分布、神经细胞衰老机制、基因治疗、组织工程等神经科学的研究，成为遗传性、获得性神经的一个新的研究途径。
原代细胞分离培养的思路：

取材--分离--培养--鉴定

首先将组织从机体中取出，经胰dan白酶/胶原酶处理后分散成单细胞，再在合适的培养基中培养，使细胞繁殖到一定系数后进行细胞鉴定。

实验步骤：

一、取7-10d雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超净工作台中，将大鼠断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑,放在盛有预冷的PBS玻璃培养皿中，去除小脑和间脑。

三、将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以去除软脑膜和脑膜大血管，再放在新的盛有预冷的PBS玻璃培养皿中。

四、用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质。

五、大脑皮质放于DMEM中，剪碎成约1mm3大小，放入50ml的离心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型胶原酶，0 .025-0 .05％IV型胶原酶，200-400U DNaseI)，混匀后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室温1 000×g离心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重悬浮，充分混匀，1 000×g，20min，4℃离心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的胶原酶/分散酶，0.05-0.1％I型胶原酶，100-300U DNaseI )重悬浮，混匀，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室温离心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培养液悬浮混匀，铺于经离心形成连续梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃离心10min。

十、靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后DMEM漂洗两次(离心1000×rpm，6min，室温)，去上清液。

加入DMEM培养液(20％FBS，4ug/ml素 )重悬浮，接种于含5％的大鼠 血清37℃孵育过夜所制备的细胞培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱内静置培养24h后更换不含素的混合培养基，随后隔天换液。

注意事项：

1. 培养基于4℃条件下可保存3-6个月。

2. 在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。

3. 传代培养过程中，yi酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。

4. 建议客户收到细胞后前3天每个倍数各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和技术部沟通；由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，详尽告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪、回访直至问题得到解决。
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