人气管上皮细胞

一、细胞基本属性

培养基：含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

传代特性：可传2-3代

消化液：0.25%胰dan白酶

培养条件：气相：空气，95%；CO2，5%

细胞简介：人气管上皮细胞分离自气管组织；气管(Trachea)，呼吸器官的一部分；为后壁略平的圆筒型管状。上端平第六颈椎下缘，与环状软骨相连；向下至第四、五胸椎体(相当胸骨角平面)交界处，分左、右主支气管，分叉处称为气管杈。气管主要由14-16个半环状软骨构成，有弹性，软骨为“C”字形的软骨环，缺口向后，各软骨环以韧带连接起来，环后方缺口处由平滑肌和致密结缔组织连接，保持了持续张开状态。管腔衬以粘膜，表面覆盖纤毛上皮，粘膜分泌的粘液可粘附吸入空气中的灰尘颗粒，纤毛不断向咽部摆动将粘液与灰尘排出，以净化吸入的气体。气管上皮是气道与外界环境接触的第一道防线，不仅是各种病原体、炎症介质作用的靶细胞，还作为效应细胞合成、释放多种炎性介质和细胞因子从而参与气道炎症及免疫反应。体外培养的原代气管上皮细胞因与体内组织在形态结构和功能活动上存在很大的相似性，因此，在基础及临床研究中极为重要。

原代细胞分离培养的思路：

取材--分离--培养--鉴定

首先将组织从机体中取出，经胰dan白酶/胶原酶处理后分散成单细胞，再在合适的培养基中培养，使细胞繁殖到一定系数后进行细胞鉴定。

实验步骤：

一、取7-10d雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超净工作台中，将大鼠断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑,放在盛有预冷的PBS玻璃培养皿中，去除小脑和间脑。

三、将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以去除软脑膜和脑膜大血管，再放在新的盛有预冷的PBS玻璃培养皿中。

四、用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质。

五、大脑皮质放于DMEM中，剪碎成约1mm3大小，放入50ml的离心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型胶原酶，0 .025-0 .05％IV型胶原酶，200-400U DNaseI)，混匀后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室温1 000×g离心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重悬浮，充分混匀，1 000×g，20min，4℃离心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的胶原酶/分散酶，0.05-0.1％I型胶原酶，100-300U DNaseI )重悬浮，混匀，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室温离心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培养液悬浮混匀，铺于经离心形成连续梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃离心10min。

十、靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后DMEM漂洗两次(离心1000×rpm，6min，室温)，去上清液。

加入DMEM培养液(20％FBS，4ug/ml素 )重悬浮，接种于含5％的大鼠 血清37℃孵育过夜所制备的细胞培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱内静置培养24h后更换不含素的混合培养基，随后隔天换液。

注意事项：

1. 培养基于4℃条件下可保存3-6个月。

2. 在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。

3. 传代培养过程中，yi酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。

4. 建议客户收到细胞后前3天每个倍数各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和技术部沟通；由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，详尽告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪、回访直至问题得到解决。

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