原发登革热IgG间接法检测试剂
Panbio Dengue IgG Indirect ELISA
产品目录号01PE30
预期用途
Panbio Dengue IgG Indirect ELISA用于定性检测登革热病原血清型（1、2、3和4）血清中的IgG抗体，辅助临床实验室诊断出现临床症状或既往感染登革热病毒的患者。
概述
虫媒病毒中的登革热属通过蚊子传播，主要是埃及伊蚊和白纹伊蚊。 登革热病毒感染，与伤寒病有关，其特征是突然发热、剧烈头痛、肌痛、关节痛和皮疹。 登革热感染的严重并发症包括登革出血热和登革休克综合征。此类并发症的发病率增加与继发性感染不同登革热血清型有关。
通过ELISA对四种登革热血清型的IgG类特异性抗体进行检测，是一种诊断既往感染登革热病毒的患者的重要方法。 配对血清中IgG， 水平不断升高是活动性登革热感染的表现。传统上，血凝抑制试验（HAI）滴度被用于划分原发性或继发性感染。当前的界定方法是采用及时分离至少7天的配对血清标本检测，急性标本的HAI滴度≥ 1:2560被认为患者感染了继发性黄病毒1。
检测原理
血清中存在的登革热病毒抗体，与微孔测试条上聚苯乙烯表面附着的登革热抗原结合物相结合。 洗去剩余的血清并添加过氧化物酶标记的抗人IgG抗体。清洗微孔，再添加无色的底物系统 - 四甲基联苯胺/过氧化氢（TMB显色液）。底物被酶水解后，显色液变蓝。用酸终止反应后，TMB变黄。显色表示测试样本中存在登革热IgG抗体。
提供的材料
- 登革热抗原（血清型1、2、3和4）包被微孔板-（12x8孔）。即用型。未使用的微孔应该立即重新密封并储存于干燥环境中。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。
- 清洗缓冲液（20倍） - 1瓶，60mL 20倍浓缩磷酸盐缓冲盐水（pH 7.2 – 7.6），含吐温 20和防腐剂（0.1% Proclin™）。低温可能结晶。若去除结晶，可在37℃孵育液体至澄清。混合均匀。用19体积的蒸馏水稀释1体积的清洗缓冲液。稀释后的缓冲液可在2-25℃储存一周。
- 样本稀释剂 – 2瓶， 50 mL（粉色）。即用型。Tris缓冲生理盐水（pH 7.2 – 7.6），含防腐剂（0.1% Proclin™）和添加剂。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。
- HRP标记抗人IgG – 1瓶，15mL（绿色）。即用型。辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗人IgG，含防腐剂（0.1% Proclin™）和蛋白稳定剂。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。
- TMB显色液（TMB） - 1瓶，15mL。即用型。3,3’,5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢的混合物，存放于枸橼酸盐缓冲液中（pH 3.5 – 3.8）。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。
- 阳性质控品 – 1瓶，红色瓶盖，200μL人血清（含0.1%叠氮话钠和0.005%硫酸庆大霉素）。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。
- 校准品 – 1瓶，黄色瓶盖，850μL人血清（含0.1%叠氮话钠和0.005%硫酸庆大霉素）。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。
- 阴性质控品 – 1瓶，绿色瓶盖，200μL人血清（含0.1%叠氮话钠和0.005%硫酸庆大霉素）。有效期内储存于2-8℃可保持稳定。
- 终止液 – 1瓶，红色瓶盖，15mL。即用型。1M磷酸。有效期内储存于2-25℃可保持稳定。
Proclin™ 300是Rohm 和Haas公司的注册商标。
需要但未提供的材料
- 精确、可调节的微量移液器，含一次性吸液头（5-1000 μL容积）
- 去离子水
- 标板清洗系统
- 酶标仪，含450nm滤波器
- 计时器
- 刻度量筒
- 烧瓶
- 试管或微滴定板，用于稀释血清
注意事项
用于体外诊断
- 在制备质控品的过程中使用的所有人源性材料已经过人类免疫缺陷病毒1/2（HIV 1 /2）抗体、丙肝（HCV）和乙肝表面抗原的检测，结果为阴性。但是，任何测试方法都不能*确信，且所有人源性质控品和抗原包被微孔板都应按照潜在传染性材料处理。疾病控制和预防中心以及美国国立卫生研究院建议将潜在传染原按照生物安全二级2处理。
- 该测试只能使用血清执行。尚未建立使用全血、血浆或其它标本基质的方法。
- 不可使用黄疸或脂血症血清，以及出现溶血或微生物生长的血清。
- 不可加热，否则血清将失去活性。
- 在开始检测前所有试剂必须平衡至室温（20-25℃）。检测受温度变化的影响。微孔板在达到室温（20-25℃）之前不可从密封袋中取出。
- 直接用干净的吸液头从试剂瓶中吸出试剂。转移试剂可能导致污染。
- 未使用的微孔应该立即重新密封并储存于干燥环境中。否则将产生错误结果。
- 底物系统：
- 由于TMB易受金属离子的污染，所以底物系统不能与金属表面接触。
- 避免长时间阳光直射。
- 有些清洁剂可干扰TMB的性能。
- TMB可能呈现淡蓝色，这不影响底物的活性或测定结果。累积。
- 叠氮话钠还抑制酶标物的活性。在添加酶标物时必须使用干净的吸液头，避免携带其它试剂的叠氮话钠。
标本采集和制备
静脉穿刺获取的血液应该置于室温（20-25℃）下直到凝块形成，再按照临床实验室标准化研究院（CLSI）的《认可标准——诊断用血液标本的静脉穿刺采集程序，H3》离心。应该尽快分离血清。如果在2天内不进行检测，血清应该2-8℃冷藏或者低于或等于- 20℃冷冻储存。不*使用自解冻冷冻机储存血清。不*使用黄疸血清，以及出现溶血、脂血或微生物生长的血清。CLSI提供了储存血液标本的建议，《认可标准——血液标本的处理加工程序，H18》。
检测程序
注： 确保所有试剂在开始测定前平衡至室温（20-25℃）。在所给时间和温度范围以外进行测试可能产生无效的结果。不在预定时间和温度范围内的测试必须进行重复。
ELISA程序
- 从铝箔袋中取出所需数量的微孔板并插入测试条槽。阴性质控品、阳性质控品和校准品各需5个微孔，一式三份。确保剩下未使用的微孔密封于铝箔袋内。
- 使用适当的试管或微滴定板稀释阳性质控品（P）、阴性质控品（N）、校准品（CAL）和患者样本。
- 混合10μL血清与1000μL样本稀释剂。混合均匀。
或者，
- 混合10μL血清与90μL样本稀释剂。取出20μL稀释血清，加入180μL样本稀释剂。混合均匀。
- 吸取100 µL样本稀释剂、质控品和校准品添加至对应的微孔中。
- 盖住测定板并在37°C ± 1°C孵育30分钟。
- 用稀释后的清洗缓冲液洗6次（参考清洗程序）。
- 吸取100 µL HRP标记抗人IgG添加到每个微孔中。
- 盖住测定板并在37°C ± 1°C孵育30分钟。
- 用稀释后的清洗缓冲液洗6次（参考清洗程序）。
- 吸取100 µL TMB添加到每个孔中。
- 在室温（20-25℃）下孵育10分钟，从第①次添加开始计时。蓝色将会显现。
- 按照相同顺序吸取100μL终止液添加到每个孔中，计时同TMB添加步骤。混合均匀。蓝色将变成黄色。
- 在30分钟内读取每个孔在450nm波长的吸光度，参考滤波器为600-650nm。
注： 如果使用双波长分光光度计，将参考滤波器设定在600-650nm之间。在没有参考滤波器的情况下读取450nm的微孔结果可能由于背景原因导致吸光度偏高。
清洗程序
为了清除未复合的样本或成分，有效清洗是ELISA程序的关键步骤。
A.自动洗板机
- *抽净所有微孔。
- 在清洗循环期间将每个孔装满至边缘（350μL）。
- 完成6次清洗后，将测定板倒立于吸水纸巾上用力敲打，确保清除所有清洗缓冲液。
- 为了确保有效清洗，必须维持自动洗板机良好的保养。必须始终遵守厂商的清洁说明。
B.手动清洗
- 将测定板的内含物丢弃到适当的废物容器。
- 用适当的挤压瓶将微孔填满清洗缓冲液。避免清洗缓冲液起泡，否则会降低清洗效率。立即丢弃微孔里的清洗缓冲液。
- 再将微孔填满清洗缓冲液，并立即丢弃。
- 重复步骤（3）4次，共用清洗缓冲液清洗六（6）次。
- 后一次清洗完成后，丢弃微孔的内含物并将测定板置于吸水纸巾上敲打，以确保清除所有清洗缓冲液。
原发登革热IgG间接法检测试剂
