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EN1（Engrailed 1）抗体（N-term）

亲和纯化兔多克隆抗体 (Pab)

用 EN1 Antibody (N-term) (Cat#AP7278a) 染色的 U251 细胞的荧光图像。用 4% PFA 固定 U251 细胞（20 分钟），用 Triton X-100 透化（0.1%，10 分钟），然后用EN1 一抗（1:25，37℃ 1 h）。二抗使用 Alexa Fluor® 488 偶联驴抗兔抗体（绿色）（1:400，37℃ 50 分钟）。细胞质肌动蛋白用 Alexa Fluor® 555（红色）偶联鬼笔环肽（7units/ml， 1 h at 37℃)。EN1免疫反应性明显定位于Nucleus。

产品信息

应用     IF、IHC-P、WB、E

初次加入       Q05925

反应性    人类, 老鼠

主持人    兔子

克隆性    多克隆

同型       兔免疫球蛋白

计算的 MW   40115 大

抗原区    1-30个氨基酸

附加信息

基因识别       2019

其他名称       Homeobox protein engrailed-1, Homeobox protein en-1, Hu-En-1, EN1

目标/特异性  这种 EN1 (Engrailed 1) 抗体由用人 EN1 (Engrailed 1) N 末端区域 1-30 个氨基酸之间的 KLH 偶联合成肽免疫的兔子产生。

稀释       IF~~1:25

WB~~1:2000

IHC-P~~1:25

格式       含有 0.09% (W/V) 的 PBS 中纯化的多克隆抗体。该抗体通过蛋白 A 柱纯化，然后进行肽亲和纯化。

贮存       在 2-8°C 下冷藏长达 2 周。如需长期储存，请以小等份在 -20°C 下储存，以防止冻融循环。

防范措施       EN1 (Engrailed 1) Antibody (N-term) 仅供研究使用，不得用于诊断或治疗程序。

蛋白质信息

姓名       EN1

功能       需要正确形成顶端外胚层脊和正确的肢体背腹模式。

蜂窝定位       核。

A. 细胞溶解剂的制备。采用胰蛋白酶消化法和旋转法收集细胞(汇合 t-25)。用100 ul 溶解缓冲液溶解球10分钟。500,000细胞，lyze with 20 ul. 3。转速14000转/分(16000克) ，在4 ° c 下微加速10min。将上清液转移到一个新的试管中，然后丢弃小球。测定蛋白质浓度(bradford 法，a280，或 bca)(我们使用 bio-rad 的 bradford 法)图6。取 x ul (= y ug 蛋白质) ，与 x ulof 2倍的样品缓冲液混合。煮5分钟，冷却5分钟。8。快速旋转降低凝结，加载凝胶 b。聚丙烯酰胺凝胶(14.5 cm × 16.5 cm)1。琼脂糖塞: 1% 琼脂糖溶于1 × 分解胶体缓冲液中。(我做50毫升，需要的时候就继续融化，然后再加水来保持琼脂二。)图2。凝胶: 24毫升9% 凝胶5.4毫升40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺(29:1的混合物)3毫升8x 分辨凝胶缓冲剂15.6毫升水12ul temed60 ul 20% 过硫酸铵3。堆叠凝胶: 8毫升40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺(29:1的混合物)2毫升4 × 堆叠凝胶缓冲剂5毫升水8 u l/d 21.6 u l/20% 过硫酸铵

C. 凝胶的制备。组装玻璃板和隔板(1.5毫米厚)。倒入琼脂糖塞子(1-2毫米)。将流动凝胶倒入梳子孔下约1厘米处(约20毫升)。用1ml 水饱和正丁醇密封。(可以在这里停下来，如果你愿意的话，可以把这个胶留在这里。)5.凝胶凝固后，倒出丁醇，用去离子水冲洗。倒入堆积凝胶(约5毫升) ，立即插入组织块。凝胶凝固后，放入明胶中浸泡。8。在运行凝胶之前，用运行缓冲器*冲洗油井。运行 gel1。在快速旋转样品后，装入井中。2。记得用记号笔。我们直接使用15号 ulbio-rad kaleidoscope 标准 # 161-0324。在恒定电流(35-37ma，电压设置大于150v)下运行。4。通常播放时间是1.3小时。使用预制凝胶(来自 bio-rad 的预制凝胶)1。在凝胶装置中组装凝胶2。准备蛋白质样品(10微克就够了)。

图3。使用5ul 的万花筒标准。在200v (恒定电压)下运行30min.f。膜制剂。切一块 pvdf 薄膜(milliporeimmobilon-p # ipvh 00010)。2。在摇床上浸入甲醇5分钟。去除甲醇，加入1xtransfer buffer 直到可以使用。膜转移。为 bio-rad‘ stransblot 组装”三明治”2。预湿海绵，滤纸(略大于凝胶)在1 × 吸水缓冲器。海绵-滤纸-凝胶-滤膜-滤纸-海绵。转移1小时15伏，在4 ° c 的搅拌板上。更大的蛋白质可能需要更长的转移时间。对于迷你传输，100v1小时，加上冷敷和缓冲液。4。用氨基黑染色法浸泡膜5分钟。用脱色缓冲液固定4 × 5分钟。完成后，在室温下浸泡隔膜一小时。抗体和检测。在室温条件下，与一级抗体稀释至2ug/ml，总体积为3ml 的阻滞缓冲液中孵育1小时。用0.05% 吐温20焦清洗4 × 5分钟。与二级抗体1:10,000(hrpoanti-rabbit)在阻滞缓冲液中培养1小时，室温4。用0.05% 吐温20毫升洗涤4 × 5分钟。用皮尔斯化学发光试剂盒(prod # 34080)检测。

I 剥除斑点1。用0.05% 的吐温20在 pbs 上冲洗污渍。2。把污渍放进卡帕克袋子里，切成略大于污渍的大小。3。加入大约5至10毫升的剥离缓冲液。尽可能多地排除空气和密封袋。5。浸泡在80 °c 水浴中20分钟。用0.05% 的吐温20在 pbs 上清洗污渍。7。用5% bsa/tween20阻滞约1小时，或用3% bsa/tween20阻滞一夜。用于维斯特斯裂解缓冲液的缓冲液: 0.15 m nacl5毫米 edta，ph 值81% triton x10010毫米 tris-cl，ph 值7.4，使用前添加: 1:10005 m dtt1:1000100毫米 pmsf 在异丙醇中1:10005 m ε-aminocatacid2x 样品缓冲液: 130毫米 tris-cl,ph8.020% (v/v)甘油4.6% (w/v) sds0.02% 溴苯酚蓝2% dtt8x 分辨凝胶缓冲液: 100 ml0.8 g sds (最后加入)36.3 g trizma 碱(= 3 m)用浓缩 hcl4x 凝胶缓冲液: 100 ml 调整 ph 为8.80.4 g sds (最后加入)6.05 g trizma base (= 0.5 m)调整 ph 值为6.810 x 运行缓冲液: 1 l30.3 g trizma base (= 0.25 m)144 g 甘氨酸(= 1.92 m)10 g sds (= 1%) -- 最后加入

不要调整 ph 值! ！10x 吸墨缓冲液: 1 l30.3 g trizma base (= 0.25 m)144 g 甘氨酸(= 1.92 m) ph 值应为8.3;。为防止细菌污染，将缓冲液剥离: 0.5 l (无菌过滤液，保持在4 °c)0.2 m 甘氨酸，ph 值2.50.05% 吐温20

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