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培养成纤维细胞应该使用什么培养基？有关单个细胞系的培养基的详细信息，请参阅 目录，在单个样本详细信息页面的“培养协议”选项卡中。在使用之前，我们将 L- 氨酰胺(或等效物)加入到2mM 的最终浓度中。如果细胞培养基的长期储存不成问题，可以使用含有氨酰胺(或等效物)的商业制备培养基。科里尔研究所不使用抗生素或抗真菌药物，因为在细胞储存库中存在隐性感染的危险。如果需要，研究人员可以添加抗生素。如果细胞培养比预期的要慢，我们的第一种方法是切换到另一批预先测试的血清和/或改变血清浓度5% 。生长缓慢的其他原因包括: 微生物污染，过于频繁的继代培养，继代培养过低密度播种，细胞系衰老，培养基组成的变化，以及培养箱在调节温度、湿度或 CO2方面的不足

如何处理新接收的成纤维细胞培养？程序: 1。观察细胞片的汇合情况，细胞形态和污染迹象。用消毒液擦拭培养瓶，放在37 °C 的培养箱中过夜，放下细胞片。不要移除培养基(只含有5% 的 FBS 以减缓运输过程中的生长)。第二天，如上所述检查烧瓶，根据培养物的汇合情况，要么通过取出运输培养基并用约5ml 生长培养基覆盖细胞来喂养烧瓶，要么根据下面概述的程序继代培养细胞。当继代培养一个新收到的成纤维细胞培养物时，必须确定正确的传代数。如果提交表或瓶子上注明了通过号，继代培养的瓶子应该得到下一个连续的通过号。

成纤维细胞系是如何继代培养的？供应• HBSS 中的0.53 mM EDTA • HBSS 中的0.04% 蛋白酶/0.53 mM EDTA •成纤维细胞生长培养基程序: 1。通过抽吸去除中间部分。2。使用试剂的适当体积见表1。3。加入适量的 EDTA 溶液到烧瓶中，不要移动电池片，将烧瓶的电池面朝下放置。

4.通过倒置显微镜仔细观察细胞长达10分钟。如果细胞开始变圆或离开烧瓶，立即取出 EDTA 溶液。5。用 EDTA/蛋白酶溶液取代 EDTA 溶液。6。将烧瓶置于摄氏37度的环境下培养4至7分钟。这些细胞会聚集起来，然后从烧瓶表面分离出来。7。拧紧瓶盖，轻轻地敲打瓶子的侧面，把剩余的细胞从瓶子里取出来。8。用显微镜检查烧瓶，确保细胞全部分离。如果7分钟后细胞没有分离，再培养1到2分钟。9。用生长培养基(停止培养基)清洗烧瓶的背面，使蛋白酶失活，然后轻轻地将细胞和培养基混合。10。删除一个细胞计数等分试样，并计数细胞。11。根据表2.12给烧瓶播种。将烧瓶放置在一个保温箱中，保温箱设置为适合单个细胞系的参数(通常为37 °C，5% CO2) ，如果没有通风，则松开瓶盖。几个小时后检查培养物的细胞附着情况和 pH 值，继代培养间隔的时间取决于细胞系。大多数哺乳动物细胞系需要每5-7天进行一次亚培养。如果培养时间超过5天，每3-4天更换一次培养基。

成纤维细胞培养物如何冷冻用于低温储存？用品• HBSS 中的0.53 mM EDTA • HBSS 中的0.04% 蛋白酶/0.53 mM EDTA •成纤维细胞生长培养基•成纤维细胞冷冻培养基(含10% 甘油或5% DMSO 的生长培养基)程序1。如果细胞在10% 的甘油中冷冻，完整的冷冻培养基可以保持在室温下直到使用。以二甲基亚砜配制的冷冻介质应冷藏至使用为止。用显微镜检查每个要冷冻(冷冻池)的烧瓶是否有污染和任何不寻常的生长模式。一个烧瓶应该作为一个“备用”烧瓶，直到可以检查冷冻的可行性。3。对于每个烧瓶，按照上面的子培养步骤1-9进行。4。转移细胞悬浮液从所有烧瓶和池细胞在离心机瓶坐在冰上。5.从冷冻池中取出一份等分试样进行计数，计算细胞数并计算出冷冻池中存活的细胞总数。6。将冷冻池以60-100克的温度在8-10 °C 下离心10分钟。取出上清液，用温和的研磨冷冻培养基以每毫升至少5 × 105个活细胞的最终浓度重新悬浮细胞团。将1毫升细胞悬浮液分装到玻璃安瓿或塑料冷冻瓶中。9。使用氧丙烷火焰密封玻璃安瓿。检查每个玻璃安瓿是否有在4 °C 浸泡在甲蓝/乙醇中密封时形成的针孔或玻璃气泡。10。将安瓿或冷冻瓶以每分钟 -1摄氏度至 -80摄氏度的速度冷冻(在微处理器控制的冰箱中或被动地置于异丙醇浴中，在 -80摄氏度的冰箱中过夜)。将冷冻细胞储存在液氮中。将玻璃安瓿浸入液体中，在气相中储存塑料冷冻瓶。

如何从低温储存中回收成纤维细胞培养物？程序1。准备适当的培养基。从冷冻储存的容器中取出一个安瓿或冷冻瓶，立即放入摄氏37度的水中，用力搅拌。3。一旦全解冻，用70% 的酒精海绵或同等消毒剂消毒安瓿或冷冻瓶。用锉刀划破玻璃安瓿的颈部，然后用开瓶器打开。

4.使用无菌移液管移除安瓿或冷冻瓶中的内容物，并将其放入含有5毫升适当新鲜培养基的 T25组织培养瓶中。5。如果需要细胞计数，用1毫升移液管轻轻地混合瓶中的物质，取出0.2毫升用1:5稀释的细胞计数。将烧瓶放在适当的培养箱中，细胞表面朝下。轻轻旋转烧瓶，使细胞悬浮液均匀地分布在烧瓶表面。调整盖子以允许适当的气体交换(取决于介质的缓冲系统)。成纤维细胞培养物应在恢复后第二天用新鲜培养基重新喂养。如果通过清洗和离心去除所有的低温保护剂，一些细胞系恢复得更好。将安瓿或冷冻液转移到含有3-5毫升生长培养基的15毫升离心管中。在60-100xg 和8-10 °C 下离心5分钟。除去上清液，重新悬浮颗粒，然后转移到 T25烧瓶中，最终容量约为5毫升。如上所述，继代培养成纤维细胞所需的培养。如果1-2周后细胞无法增殖，扩大备用烧瓶进行第二次冷冻。