Protein A-agarose

货号：P0231

储存条件：4℃保存，有效期一年。请勿冷冻。

产品描述

Protein A Agarose 主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗体的纯化。

Protein A是一种发现于jin黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁表面蛋白，分子量为42kDa；适当重组改造的Protein A、G与琼脂糖凝胶(agarose)以一定的方式结合，可用于免疫沉淀或抗体的纯化。Protein A Agarose适合于免疫沉淀human IgG1、IgG2、IgG4，mouse IgG2a、IgG2b及rabbit IgG等。

本品中的重组Protein A可与多数哺乳动物IgG的Fc端特异性结合，分子量为14kDa。该重细Protein A经过基因工程技术的改造，使其成为耐碱结构域，从而实现Protein A的耐碱特性，并仅保留了与IgG Fc端结合相关的氨基酸序列，去除了结合位点以外可能导致非特异性结合的序列，从而可以有效减少非特异性结合。

本品中的Protein A共价连到大孔径琼脂糖上。每ml Protein A agarose beads (沉淀物)可以结合超过60mg human IgG。本品中agarose beads的平均直径为45-165um，抗体纯化时的推荐线性流速为，400cm/h，耐压指数最高为0.5MPa。工作pH值范围为3-12。

本产品配制在可以直接用于免疫沉淀和抗体纯化的适当溶液中，每ml中共含有0.25ml agarose beads (沉淀物)。如果用于常规的免疫沉淀，每ml本产品(沉淀和溶液为1:3的混合物)可以免疫沉淀50次。

注意事项

1.请勿冷冻保存本产品。

2.Protein A Agarose使用前一定要充分重悬，即充分颠倒若干次使混合均匀。

3.本产品含有微量的防腐剂，不会影响常规的免疫沉淀和抗体纯化。但如果后续涉及酶活性测定，使用本产品前宜先用TBS等适当溶液洗涤Protein A agarose beads三次，以充分消除防腐剂可能产生的干扰。

4.从蛋白样品收集开始，所有步骤中蛋白样品都必须在4度或冰上操作。

5.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

6.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:

1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):

a. 蛋白样品的准备:

(a) 对于10cm细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500ul至2ml细胞裂解液裂解细胞。可使用LABLEAD生产的Westen及IP细胞裂解液（Cat：W0013）或各种RIPA裂解液（Cat：R1090/R1091）等进行细胞的裂解。

(b) 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。

(c) 对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。

注:详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材，参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。

b. 去除非特异性结合(可选做):

(a) 取200ul~1ml蛋白样品，蛋白量约为200ug至1mg，加入约1ug和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG.

和20ul充分重悬的Protein A Agarose，4°C缓慢摇动30min至2h。

(b) 2500rpm(约1000g)离心5min，取上清用于后续的免疫沉淀。

注：所谓种属相同的IgG是指后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG，如无normal IgG，可以加入其它不影响后续检测的mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A Agarose的孵育，可以充分降低非特异性的结合，降低背景。

c. 免疫沉淀：

(a) 加入0.2-2ug用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。

(b) 再加入20ul充分重悬的Protein A Agaose，4℃缓慢摇动1-3h(为方便后续的洗涤操作，可以把加入充分重悬的Protein A Agatose的量调整为40ul)。

(c) 2500rpm(约1000g)离心5min，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意可留下少量上清但不能吸掉Protein A Aganose。

(d) 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1ml。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同步骤(c)。

(e) 完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40ul 1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Votex重悬沉淀，瞬时高速离心把样品离心至管底。

(f) 100°C或沸水浴处理3-5min，取部分或全部样品用于SDS-RAGE电泳，暂时不用的样品可以-20°C保存。

2．免疫共沉淀:

参考免疫沉淀的方法进行，但免疫共沉淀(Co-P)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品，但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。

3．抗体纯化:

a. 准备工作：

(a) 用0.45um或0.2um孔径的滤膜过滤所用的溶液。

(b) 所有的溶液必须用超声等方法脱气(degas)。

(c) 选择适当的纯化柱，用适当量的Protein A Agarose装填纯化柱。也可使用LABLEAD的预装柱产品（Cat:P0231G）

(d) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤并平衡纯化柱，流速可以用恒流泵控制为1ml/min (1ml预装柱)。如无恒流泵，也可以完quan依靠重力洗涤并平衡纯化柱。

b. 抗体纯化：

(a) 把含有待纯化的抗体上样到纯化柱。

(b) 待纯化的抗体过柱后，用10-20倍柱体积的TBS洗涤，以去除未结合和非特异性结合的蛋白。洗涤是否完quan可以通过测定280nm的吸光度进行确定。

(c) 洗涤完后，用10ml 50mM glycine，pH2.7作为洗脱液洗脱结合的抗体。某些抗体和Protein A的结合能力很强，在pH2.7时洗脱效果不太理想，可以使用50mM glycine，pH1.9作为洗脱液。分管收集洗脱下的抗体，根据蛋白浓度或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。

c. 纯化柱的再生：

(a) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤纯化柱，使纯化柱达到中性的pH。

(b) 用TBS来保存再生的纯化柱。