biotin-TUNEL细胞凋亡试剂盒

货号：B0068

存储条件：本产品应置于-20℃储存，组分 A、E、G 需避光，避免反复冻融。有效期见外包装。

注：组分 A、E、F、G 使用时请佩戴口罩、手套，接触皮肤，请立即用大量水冲洗。

产品组分：

产品简介：

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体DNA 的降解， 这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为 180bp-200bp的整数倍，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状Ladder图谱，本试剂盒采用TUNEL法，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）在凋亡细胞断裂DNA的3´-OH末端催化掺入生wu素（Biotin）标记的dUTP (Biotin-X-dUTP)。随后和辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的Streptavidin(Streptavidin-HRP) 特异结合， 最后在 HRP 的催化下通过DAB 显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜观察并计数凋亡细胞。由于正常的或正在增值的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有 3´-OH 形成，很少能被染色。TUNEL法可以选择性的对凋亡细胞直接进行原位检测，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的DNA链断裂的细胞，是一种更快速、直接的检测手段。

使用方法：

实验材料（自备）

PBS 缓冲液（pH~7.4）

4%多聚jia醛（PBS 配制）

PBS 配制 0.3% H2O2（新鲜配制）

70%乙醇（自选）

脱蜡溶剂（石蜡切片样本）

注意事项：

1. 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。

2. 在使用DAPI荧光封片剂的情况下，虽然可减缓淬灭，仍需尽量避光。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

实验步骤

1.样本准备：

（1）细胞样品

a. 可选：准备一份阴性对照样本（加入不含TdT酶的TUNEL反应液）。

b. PBS 清洗细胞两次。

c. 细胞固定：加入适量4%多聚jia醛（pH 7.4）溶液，4℃放置30min。

d. PBS清洗细胞两次。

e. 通透细胞：细胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透，室温放置 20 min。

f. PBS清洗细胞两次。

g.封闭细胞：每孔加入100μL左右的配制于PBS中的0.3% H2O2溶液，轻敲孔板使其充分覆盖细胞，室温避光封闭30min，用 1×PBS 清洗细胞 2 次；

（2）石蜡组织切片

a.室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次，每次5 min， 以彻di脱掉石蜡。

注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。

b.室温下，将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗2次，每次5 min。

c.室温下，将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇

（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗1次，每次5 min。

d.室温下，将切片浸没于纯水中漂洗3 min，再将切片浸没于1×PBS中漂洗3 min，用滤纸小心吸干切片样本周围液体。

e.用免疫组化笔围描绘样品轮廓，以便下游通透与标记。

f.按1: 100的比例，将2mg/mL的蛋白酶K溶液用1×PBS稀释至终浓度20µg/mL，在每个样本上滴加 100 µL，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育20min（蛋白酶K的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。

注：蛋白酶K可以帮助渗透组织，时间短达不到通透效果， 但延长孵育时间可能导致切片脱落。一般情况下，厚度4µm孵育10min，厚度30µm孵育30min。

g.PBS浸润清洗切片两次，每次5min。

h.封闭：加入适量配制于PBS中的0.3% H2O2溶液（新鲜配制），室温孵育30 min，以灭活切片内源的过氧化氢酶。

i.PBS浸润清洗切片两次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

（3）冰冻组织切片

a.将冰冻切片放置于室温的片架上，室温20 min，晾干。

b.将载玻片浸没在4%多聚jia醛溶液中，室温固定30 min。

c.PBS浸润清洗切片两次，每次5 min。

d.用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。

e.按1:100的比例，将2 mg/mL 的蛋白酶K溶液用1×PBS 稀释至终浓度20 µg/mL。每个样本上滴加 100 µL，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育10min（Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。

注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，时间短达不到通透效果， 但延长孵育时间可能导致切片脱落。一般情况下，厚度4 µm孵育10 min，厚度30 µm 孵育30 min。

f.PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min。

g.封闭：加入适量配制于PBS中的0.3% H2O2 溶液（新鲜配制），室温孵育30 min，以灭活切片内源的过氧化氢酶。

h.PBS清洗样品3次，每次5min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

（4）阳性处理（仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行TUNEL反应步骤）

a.按1:10的比例用 ddH2O 将10×DNase I Buffer 稀释成1×DNase I Buffer 备用。

b.滴加100 µL 1×DNase I Buffer 到已通透的样本上，室温平衡5 min。

c.用1×DNase I Buffer以1:100稀释DNase I (2 U/μL)，使其为终浓度20 U/mL 的工作液。

d.轻轻吸掉多余液体，加入100μL浓度为20 U/mL DNase I工作液，室温孵育10min。

e.轻轻吸掉多余液体，PBS 清洗样品2次。

2.TUNEL 反应

（1）配制TUNEL 反应液（即用即配）：

（2）每个样本加入 50 μL TUNEL 反应液，使反应液均匀覆盖样本。37℃孵育 60 min。

注：50μL TUNEL 反应液适合涂片、切片或 96 孔板（其他不同孔板可以适当调整 TUNEL 反应液体积，覆盖细胞即可）。

如果待检测的样品为涂片、切片或在 24 孔板、12 孔板或 6 孔板中，可以使用防蒸发膜，或自行尝试使用自封袋或者其它适当材料自行裁剪成比孔略小的圆形塑料片，滴加 TUNEL 反应液后覆盖在样本上，可以防止 TUNEL 反应液蒸发，并且使TUNEL 反应液均匀覆盖样本。

（3）弃去 TUNEL 反应液，PBS 清洗 2 次。

3. Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液的配制

（1）Streptavidin-HRP 工作液的配制（即用即配）：

（2）DAB 显色液的配制（即用即配）：

4. 样品显色

（1）向样品滴加50μL Streptavidin-HRP工作液，37℃避光 孵育30 min。

注：50 μL Streptavidin-HRP 工作液适合涂片、切片或 96 孔 板、48 孔板、24 孔板或 12 孔板的一个孔，如果是 6 孔板， 建议使用 100 μL。为防止 Streptavidin-HRP 工作液蒸发，建议在样品上覆上防蒸发膜。

（2）PBS清洗样品3次，每次5min。

（3）向样品滴加50μL DAB 显色液，室温孵育5-30 min或在显微镜下根据颜色的发展情况掌握染色时间。 注：如果显色很强可短于 5 min 即停止显色，如果显色很弱， 可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。

（4）PBS 清洗样品3次，每次5 min。

（5）选做：用苏mu素染色液或甲基绿染色液进行细胞核染色。随后用PBS清洗 3 次。

（6）直接光学显微镜下观察。针对石蜡切片，如果需要封片，使用95%乙醇脱水5 min，再用100%乙醇脱水2次， 每次3min，再用二甲苯透明2次，每次5min。