2x示踪型定量试剂盒

货号：R0212

储存条件：长期保存请于 -20℃避光保存，解冻后可在 4℃避光条件下稳定存放一个月，尽量避免反复冻融。

产品组分：

产品描述

2x Visual Realab Green PCR Fast mixture通用型（示踪型定量试剂盒）是SYBR Green l嵌合染料法专用 qPCR 试剂，为2x预混液，包含除引物和 DNA 样品以外的所有 qPCR 组分，可减少操作步骤，缩短加样时间，降低污染几率。其核心组分是经抗体修饰的热启动 Tag DNA 聚合酶，配合精心优化的 Buffer 体系以及 PCR 反应促进因子，特异性强、扩增效率高，可有效抑制非特异性扩增，对宽广浓度范围的模板进行准确定量，获得稳定可靠的 qPCR结果。本品已含有通用校正染料，与绝大多数 qPCR 设备兼容，不需要额外添加染料来校正仪器。

本品可利用不同染料混合后产生的变色效应，追踪移液过程，从而显著减少移液错误。2x Visual Realab Green PCR Fast mixture通用型中包含蓝色染料，10x Dilution Buffer 中包含黄色染料。当 2x Visual Realab Green PCR Fast mixture通用型(蓝色)中加入了用 Dilution Buffer稀释的模板(黄色)后会产生蓝色→绿色的变色效应，从而可以根据液体颜色准确判断是否已加入模板。

使用方法：

1. 模板稀释

使用过程中，如需要进行移液追踪，则根据下表选择合适的方式提前添加 Dilution Buffer 至模板中，然后进行 qPCR 检测;如不需要进行移液追踪，则不使用 Dilution Buffer 即可。

2. 建议的 qPCR 反应体系

a. 通常推荐的引物终浓度为 0.2 μM，可在 0.1~1 μM 范围内调整；

b. 如使用 Dilution Buffer 进行加样追踪，模板体积请勿超出2~5μl/20 μl reaction。

如果模板用量低于 2 μl/20 μl reaction，会造成显色偏淡，影响追踪效果；如果模板用量高于 5 μl/20 μl reaction，Dilution Buffer 中的成分可能会干扰 qPCR 反应。不同种类 DNA 模板中含有的靶基因拷贝数目不同，必要时可进行梯度稀释，以确定最佳的 DNA 模板添加量。

注：当模板类型为未稀释 cDNA 原液时，不论其是否包含 1× Dilution Buffer，使用体积均不应超过 qPCR 反应总体积的 1/10，即 2 μl/20 μl reaction。

3. qPCR 反应程序（可根据机型适当调整）

两步法

三步法

a.根据引物的 Tm 值进行退火&延伸(退火)温度的设定;若扩增片段在 200bp 以内，退火 &延伸(延伸)时间可以设置为 15 s;此外，退火&延伸(延伸)时间的设置还需根据您使用的 qPCR 仪所需要的最短数据采集时间自行调整。

4.实验优化

① 引物浓度调整

当引物终浓度在 0.1~1.0 μM 范围之间变化时，引物浓度越低,扩增特异性越高，但扩增效率会有所下降。

② 扩增程序优化

需提高扩增特异性，可使用两步法程序或提高退火温度;需提高扩增效率，可使用三步法程序或延长延伸时间。

5.引物设计原则

① 扩增产物长度建议控制在 80~200 bp;

② 引物长度为 18~25 bp;

③ 两条 Tm 值相差不超过 1℃，Tm 值控制在 58~62℃;

④ 引物的 GC 含量控制在 40%~60%;

⑤ 引物 A、G、C、T 整体分布尽量要均匀，避开 T/C 或者 A/G 的连续结构(特别是 3' 端)，3' 端最后一个碱基最好为 G 或者 C;

⑥ 避开引物内部或者两条引物之间的互补序列;

⑦ 使用 NCBI BLAST功能检索确认引物的特异性。