RNAi技术及其实验操作

RNAi技术及其实验操作

目前对RNAi （RNA interference）的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义：① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。
　　如果将其作为一门生物技术，则定义为：① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA（有义RNA 和反义RNA） ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA（dsRNA ） 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默（post - transcriptional gene silence , PTGS）。
　　各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。也就是说，RNAi技术是利用RNAi为原理，在体外利用化学或酶促合成siRNA，也可构建在体内合成siRNA的质粒或病毒表达载体，然后利用传统微注射磷酸钙法、电穿孔转染法、脂质体介导转染等方法转染细胞从而致使靶基因沉默的技术。RNA干扰有很多方法：①化学合成法：应用zui广泛但成本昂贵，体外合成的长21nt、3`端带有2个游离核苷酸的siRNA较其它形式合成的RNA具有更大效率的降解目的mRNA的效果。② siRNA表达载体：在质粒或病毒载体中，利用RNA聚合酶启动因子U6或T7分别控制正义链和反义链的合成并退火形成双链siRNA，或在启动子下游设计带发夹结构的表达单位，自身退火形成双链siRNA。③dsRNA表达载体：多用于果蝇、线虫等低等生物，在体内表达后被Dicer切割成21-23nt的siRNA；或在体外利用Dicer、RNaseIII切割dsRNA产生siRNA，纯化后使用。
　　zui近由于RNA干扰（RNA interference，RNAi）的发现使反义领域的研究增多。这种自然发生的现象zui早是在秀丽线虫中发现的，是序列特异性地使转录后的基因沉默的有力机制。RNA干扰是由长的双链RNA分子发动的，该分子可以被Dicer enzyme加工成长度为21-23个核苷酸的RNA。RNaseIII蛋白被认为是作为一个二聚体发挥作用，它对双链RNA的两个链都进行切割，酶切的产物3'末端互相重叠。然后这种小的干扰RNA分子（small interfering RNAs，siRNAs）掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），引导核酸酶降解靶RNA。
　　这种保守的生化机制可用于研究多种模式生物的基因功能，但是它在哺乳动物细胞中的应用受到阻碍，因为长的双链RNA分子会引起干扰素应答。因此Tuschi及其同事表明长度为21nt的siRNA可以特异性的抑制哺乳动物细胞基因表达是一个革命性的突破。这个发现激发了大量利用RNAi技术对哺乳动物细胞的研究，因为与传统的反义技术比，RNAi的性能明显较高。
　　有趣的是，除了短双链RNA，短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA），比如茎环结构在细胞内经过加工后也可以变成siRNA，从而产生RNA干扰。这使得构建表达干扰RNA的载体，从而使哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能。shRNA可以利用RNA聚核酶III启动子转录，在正常情况下，该启动子是控制小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6或者RNaseP的组分H1 RNA转录的。另外一种办法是两段短RNA分子分别用U6启动子转录出来。载体介导的siRNA表达使对功能缺失（loss-of-function）表型进行长期分析成为可能。在稳定转染的细胞内，两个月后仍可观察到沉默现象。
　　另外一种延长siRNA抑制基因表达时间的方法是对化学合成的RNA进行核苷酸修饰。尽管未经修饰的短双链RNA在细胞培养物或者体内的稳定性出乎意料的高，然而有些情况下，需要对siRNA的稳定性进行进一步提高。因此，可以在两条链的末端都引入经过修饰的核苷。一个5'端为两个2'-O-甲基RNA、3'端为4个甲基化核苷的siRNA与序列相同但是未经修饰的siRNA比活性相同，但是在细胞培养物中引起的基因沉默现象的时间延长。然而，增多siRNA中的甲基化核苷，或者在核苷中引入体积较大的烯丙基将导致siRNA活性下降。
　　RNA干扰在哺乳动物体内的*个研究是利用快速注射大量生理溶液的方法将一个编码shRNA的质粒注入老鼠的尾静脉。在大多数器官中，报道基因（编码于共转染质粒或者转基因小鼠上）的表达可以被有效地抑制。另外，Fas基因被作为肝损伤治疗相关的内源靶标进行了RNA干扰实验。注射siRNA之后，小鼠肝细胞中的Fas mRNA和蛋白水平下降了10天。把Fas基因沉默可以保护小鼠免遭由注射竞争性Fas特异抗体引起的爆发性肝炎，82%用siRNA处理的小鼠活过了10天观察期，而所有的对照小鼠在3天之内死亡。
　　上述研究中采用的高压导入技术是一种粗暴的方法，不适于治疗用。因此，标准的基因治疗所采用的方法被用于RNA干扰。一个反转录病毒载体被用于导入siRNA，以抑制人类胰腺肿瘤细胞中的癌基因K-ras等位基因。负调控癌细胞中K-ras基因的表达使得它们在注入无胸腺的裸鼠皮下之后不再具有形成肿瘤的能力。这项研究还表明siRNA的高度特异性，因为只有癌基因K-ras被沉默，而与之只有1个碱基对差异的野生型等位基因并没有被沉默。另外，当在纹状区注射表达siRNA的腺病毒之后，转基因小鼠大脑中GFP基因的表达可以被抑制。β－葡萄糖醛酸苷酶（b-glucoronidase）的活性可以通过在小鼠尾静脉注射重组腺病毒抑制。有趣的是，具有CMV启动子和zui小的polyA尾的RNA聚合酶II表达元件被用于这个实验，为设计组织特异性或者可诱导的siRNA载体打开了大门。
　　总的来说，siRNA的*个体内实验已经进行，其他有重要意义的基因有望于很快作为靶标开展研究。至今为止的研究没有观察到任何应用siRNA引起的毒性作用，但是在治疗人类疾病的临床试验开始之前仍需小心，以排除长期使用RNA干扰引起的严重副作用。因为用siRNA使基因表达沉默与传统的反义技术相似，研究者将从十多年来反义技术研究的教训中获益，比如需要使用合适的对照以证明基因表达的敲除是特异性的，以及对免疫系统可能引起的意外影响进行详细分析。
　　经过长期盛衰沉浮，反义技术近年来得到越来越多的注意。对能够提高靶表亲和性和生物稳定性、降低毒性的修饰核苷的研究取得了重要进展。由于大多数新的DNA类似物不能激活RNaseH，对反义寡核苷酸的设计需要考虑靶mRNA是否需要保留，例如，是改变剪接方式，还是降解靶mRNA（这种情况下应该使用gapmer技术）。可以通过有系统的修饰天然核酶或者通过体外选择技术获得具有高催化活性的稳定核酶。一些反义寡核苷酸和核酶已经进入临床试验研究，一个反义药物已经在1998年获得批准。一个重要的突破是发现短的双链RNA分子可用于哺乳动物细胞中特异性沉默基因表达。这个方法与传统的反义技术比效率明显更高，并且一些体内实验的数据已经发表。因此，反义技术有望广泛应用于对未知功能基因的研究、药物靶标的确认和治疗。

RNAi的发现

RNA干扰（RNAinterference，RNAi）现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA（doublestrandRNA，dsRNA）导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失，这一过程属于转录后基因沉默机制（posttranscriptionalgenesiliencing，PTGS）范畴。RNAi广泛存在于生物界，从低等原核生物，到植物，真菌，无脊椎动物，甚至近来在哺乳动物中也发现了此种现象，只是机制也更为复杂。
早在1990年进行转基因植物有关研究时偶然发现，将全长或部分基因导入植物细胞后某些内源性基因不能表达，但这些基因的转录并无任何影响，并将这种现象称为基因转录后沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）.1996年在脉孢菌属（Neurospora）中发现了相似现象，只不过将这种现象命名为基因表达的阻抑作用（quelling）.发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditiselegans的研究。1995年康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA去阻断par－1基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义RNA的确能够阻断par21基因的表达，但是奇怪的是，注入正义链RNA作为对照，也同样阻断了基因的表达。这个奇怪的现象直到3年后才被解开——华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心的CraigMello将双链dsRNA——正义链和反义链的混合物注入线虫，结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA已经足够*阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链RNA不单可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其*代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为RNA干扰。
过去认为，哺乳动物细胞中不存在RNAi现象，因为较长的dsRNA在哺乳动物细胞中能诱导IFN（干扰素）生成，并激活STAT途径参与的PKR（dsRNA依赖性激酶）的转录，同时dsRNA本身与PKR结合也能令其激活，继而磷酸化翻译起始因子eIF2a使之失活，导致非特异性的蛋白质合成障碍；另一方面，dsRNA又能诱导细胞产生多种抗病毒蛋白的2′，5′腺苷合成酶，生成2′，5′腺苷酸，激活非特异性的RNA酶L，发生非特异性的RNA降解效应。现在发现，只要dsRNA短于30bp，就不会促发干扰素效应，同时又能特异性地降解mRNA，引起基因沉默，说明dsRNA在哺乳动物细胞中也能发挥一定作用，为以后的基因治疗等RNAi应用领域提供了新的研究方向。
RNAi的详细机制和过程还不十分清楚，目前大致分为以下几个阶段进行：①siRNA的形成阶段：此阶段需要Rde-1,Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。Rde-1,4编码的蛋白识别外源dsRNA，引导dsRNA与Dicer结合，然后，Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为21-25 nt大小的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。Dicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后在向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为21-25nt大小并在3′端带有2-3个碱基悬端且5′端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应zui强。Dicer家族在进化上非常保守，有5个组成部分：N-端RNA解旋酶结构域、1个PAZ结构域（Piwi，augonaute，Zwille/pinehead，PAZ）、2个 RNaseIII结构域和C端dsRNA结合基序。Dicer在体内一般是以二聚体的形式发挥作用的，由于不同种族Dicer分子大小不一样，所以dsRNA被切割成的siRNA大小具有种族差异。② RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silicencing complex，RISC）形成阶段：生成的siRNA和RNAi特异性酶如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC，具有序列特异性核酸内切酶、核酸外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA。③效应阶段： siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合，在ATP及解旋酶（如qde-3，mut-6，mut-14）的作用下使siRNA链解离，并使RISC由250kD大小的前体形式变成约100kD左右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链相互交换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5′起始端下游7-10个核苷酸处切断mRNA，起到特异的抑制基因表达的效果。④扩增阶段：该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为摸板，在RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下，扩增靶mRNA，产生新的二级siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA。RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链RNA转变dsRNA。RdRP还是一个重要的“sensor”，它能识别正常和异常的RNA。转基因RNA和病毒RNA都是在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程。此外，RNAi的扩增效应还可能存在另外两种机制：①Dicer将长dsRNA切成初级siRNA ，这一放大水平取决于dsRNA的长度；②siRNA在酶的作用下可以多次应用，产生进一步的放大效应。

RNAi的作用机制

干扰性小RNA（smallinterferingRNA，或shortinterferingRNAs，siRNA）是RNA干扰作用（RNAi）赖以发生的重要中间效应分子.siRNA是一类长约21～25个核苷酸（nt）的特殊双链RNA（dsRNA）分子，具有特征性结构，即siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基.此外，每条单链的3′端均有2～3个突出的非配对的碱基RNAi的主要过程是，dsRNA被核酸酶切割成21～25nt的干扰性小RNA（siRNA），由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子.细胞中dsRNA的形成是RNAi的*步.细胞中dsRNA可通过多种途径形成，如基因组中DNA反向重复序列的转录产物；同时转录反义和正义RNA；病毒RNA复制中间体；以及以细胞中单链RNA为模板由细胞或病毒的RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）催化合成dsRNA等.在线虫（C.elegans）可以直接注射dsRNA或把线虫浸泡在含dsRNA溶液中等方式引入外源dsRNA，还可以通过喂养表达正义和反义RNA的细菌获得dsRNA.
现已初步阐明RNAi的作用机制.RNAi的*步是，dsRNA在内切核酸酶（一种具有RNaseⅢ样活性的核酸酶）作用下加工裂解形成21～25nt的由正义和反义序列组成的干扰性小dsRNA，即siRNA.果蝇中RNaseIII样核酸酶称为Dicer.Dicer含有解旋酶（helicase）活性以及dsRNA结合域和PAZ结构域.已发现在Arabidopsis，C.elegans，Schizosaccharomycespombe以及哺乳动物中也存在Dicer同类物.RNAi的第二步是，由siRNA中的反义链指导形成一种核蛋白体，该核蛋白体称为RNA诱导的沉默复合体（RNAinducedsilencingcomplex，RISC），由RISC介导切割靶mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而达到干扰基因表达作用.RISC由多种蛋白成分组成，包括内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA链搜索活性等.线虫C.elegans中的MUT7（一种RNaseD样蛋白）可能是一种3′5′外切核酸酶.此外，PAZPPiwi蛋白家族成员可能是RISC中的构成组分，如Arabidposis中的AGO1；N.Crassa中的QDE；C.elegans中的RDE1等，以上这些蛋白与翻译因子eIF2C同源.
研究进一步揭示，ATP在siRNA介导的RNAi中具有重要作用.较长dsRNA向siRNA的转变要有ATP参与.siRNA与蛋白因子形成一个无活性的约360kD的蛋白PRNA复合体；随之，siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白PRNA复合体（RISC），此步具有ATP依赖性.RISC活性复合体对靶mRNA的识别和切割作用，这一步可能不需ATP参与.
此外，ATP使siRNA5′端带上磷酸分子，且对siRNA的功能具有重要作用.上述过程中siRNA双链结构解旋很可能是一种稳定的结构改变，因为siRNA双链体与细胞裂解物、ATP等孵育后再除去ATP及其它辅助因子，含有siRNA的活性复合体仍能识别和切割靶mRNA分子
siRNA可作为一种特殊引物，在RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）作用下以靶mRNA为模板合成dsRNA，后者可被降解形成新的siRNA；新生成的siRNA又可进入上述循环.这种过程称为随机降解性多聚酶链反应（randomdegradativePCR）.新生的dsRNA反复合成和降解，不断产生新的siRNA，从而使靶mRNA渐进性减少，呈现基因沉默现象.RdRp一般只对所表达的靶mRNA发挥作用，这种在RNAi过程中对靶mRNA的特异性扩增作用有助于增强RNAi的特异性基因监视功能.每个细胞只需要少量dsRNA即能*关闭相应基因表达，可见RNAi过程具有生物催化反应的基本动力学特征.
miRNA与siRNA的区别：
（1） miRNA是单链的，而siRNA则是双链的；
（2） miRNA参与正常情况下生长发育基因调控，而siRNA不参与动物体的正常生长，只有在病毒或其它dsRNA诱导情况下才产生siRNA，作为miRNA的完善和补充；
（3） miRNA在转录后水平调节基因表达，推测在翻译水平也起作用，而siRNA为转录后水平调节基因表达调控；
（4） Dicer酶对两类RNA的加工过程，miRNA为不对称性，仅来自含茎－环结构RNA前体的一侧臂，剩余部分很快降解，而这种不对称性不存在于而siRNA加工过程中。

RNAi的特点

①高度特异性：有时siRNA一个碱基改变就会大大降低封闭靶基因的效果。Brummelkamp[4]等利用载体表达的小发夹RNA （small hairpin RNA，shRNA）来封闭人MCF-7细胞的CDH1基因，shRNA上仅一对碱基的突变就不能抑制CDH1基因的表达。其中siRNA的*位置碱基位点和3′末端倒数第二个碱基起了格外重要的作用。
②率：在细胞内RNAi途径一旦被启动，反应信号就被放大。在低等动物中靶基因表达抑制效率大于90%，甚至有人认为每个细胞一份拷贝的dsRNA就可以封闭基因的效果。
③高成功率：RNAi已被用于线虫全基因组的功能分析，其中有50%-80%序列选择有效，12.9%-27%的基因封闭产生了明显的异常表型。
④种属时-效性：Irie等人发现，在低等生物中RNAi可持续存在，但RNAi在哺乳动物细胞中只能维持一段时间，一般注入dsRNA后的2-3天，RNAi的作用zui明显，尔后1-2天内，靶mRNA的丰度就能恢复到注射RNAi之前的水平。这可能是由于RNA依赖的核苷脱氨酶脱氨基活性的逐步增高导致siRNA的生成减少而受到抑制。
⑤dsRNA的长度限制性：引发有效RNAi的dsRNAzui短不得短于21nt，Dicer能与200-500nt范围内的dsRNA结合，底物片段越短，Dicer酶的活性也就越弱，提示RNAi具有dsRNA片段长度限制性。⑥RNAi的遗传性：1998年Fire等就发现在线虫中RNAi可以传代，以后Worby等人在果蝇的培养细胞中也发现了类似的现象。线虫中的RNAi遗传性需要Ｒde-1和Ｒde-2来启动。
⑦传播性：RNAi效应可以在细胞间扩散，dsRNA可在果蝇细胞群落之间传播，在线虫局部注射dsRNA也可传播到整个机体。Van等研究发现sid-1基因编码一种具有十一次跨膜蛋白可能与此现象有关。
⑧ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNAi现象降低或消失，显示RNAi是一个ATP依赖的过程，可能与Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量有关。⑨模板选择性：RNAi只有效作用于外显子，而对内含子无影响。dsRNA序列是某个基因的启动子序列时也没有明显的效应。另外，RNAi 对稳定并丰富表达的靶基因抑制效率也不高。

RNAi的生物学意义及其应用

RNAi的生物学意义主要是维持基因组稳定、抑制转基因表达和保护基因组免受外源核酸侵入。研究证实RNAi缺陷可引起内源性转座子的移动。转座子沉默与DNA甲基化、H3mK9（histone H3 lysine-9 methylation）和RNAi有关，大多数转座子沉默与met1（DNA methyltransferase）、ddm1（decrease in DNA methylation 1）和sil1（Streptomyces subtilisin inhibitor-like 1）有关，而很少的转座子沉默需要KRYPTONINE（H3K9 methyltransferase）、ARGONAUTE1（RNAi gene）和CHROMOMETHYLASE3（CXG methyltrasferase）。Hall等研究表明，着丝粒同源重复序列和RNAi组分一起正负调节着异染色质的形成并且共同促使异染色质组装成核。zui近研究发现，RNAi需要的一种 AGO蛋白TbAGO2与细胞有丝分裂和染色体分离有关。dsRNA还出现在许多病毒（包括单链RNA病毒）感染的细胞内，诱发RNAi而封闭病毒生存和繁殖所必需的基因或激发干扰素诱导的抗病毒效应。RNAi还可能在胚胎发育过程中具有重要功能，也可能参与了生物体正常的基因表达调控，同时与基因印迹也有关。
RNAi是一种的特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，很快就成为功能基因组研究的有力工具。通过实验手段将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的mRNA，封闭内源性基因表达，从反向遗传的角度研究人类或其他生物基因组中未知基因的功能。早期就有人应用此项技术分离了果蝇胰岛素信号转导途径通路中的各种成分。近来也有实验报道通过RNAi研究细胞内脂质平衡过程中涉及的各条途径。在这之前，曾利用反义RNA与靶mRNA序列互补的特性来抑制其表型的发生，但由于反义RNA对内源性表达的基因抑制作用较弱，往往会产生一些过渡表型，易造成对基因功能判断错误，目前已通过审批认为临床上具有治疗作用的仅有一种药物———Vitravene。RNAi技术与之相比，特异性更高，作用更迅速，副反应小，在有效地沉默靶基因的同时，对细胞本身的调控系统也没有影响。zui近在人类体细胞里已经成功地对近20种基因功能进行了“敲除”，尤其是因此而了解了人类空泡蛋白Tsg101对HIV在人体内增殖的作用，进一步深化了对HIV的研究。Leonid等以脊髓灰质炎病毒为模型，利用RNAi来诱导细胞的胞内免疫，产生抗病毒效应，尤其是针对RNA病毒。对于易突变的病毒，可设计多种靶向病毒基因保守序列的dsRNA，减少它对dsRNA的抵抗。Maen等也应用RNAi技术成功地阻断了MCF－7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp21的功能。RNAi技术的应用，不仅能大大推动人类后基因组计划（蛋白组学）的发展，还有可能设计出RNAi芯片，高通量地筛选药物靶基因，逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能，并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学研究等领域，用RNAi技术来抑制基因的异常表达，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。
具体可用于以下几个方面：
1 基因功能分析
基因敲除技术需要较长时间去*性的关闭某个基因的表达，而RNAi技术则可在一周内、甚至2天内可控性的关闭10个基因。RNAi技术还具有一个优势，能同时封闭多个基因或基因家族，用于研究mRNA差别剪接形成的异构体，甚至在基因组水平上构建针对基因组的RNAi表达载体，用于研究基因之间的相互作用和进行基因功能的高通量筛查。使用RNAi技术在那些低等生物中基因组功能测定都已基本结束。在哺乳动物和人类基因的功能研究中，Harborth等利用脂质体及质粒分别将编码核纤层蛋白β1或β2、NUP153、GAS41、ARC21、胞质动力蛋白、蛋白激酶cdk1、β或γ肌动蛋白以及非必须结构基因emerin和zyxin的siRNA转染到Hela、SS6细胞和大鼠F5、FR成纤维细胞内，结果发现上述基因的功能表现与以往使用基因剔除法获得的信息一致。Sui等应用DNA载体体外构建目的基因的siRNA，包括外源绿色荧光蛋白、内源Lamin-A、Lamin-C、cdk-2和dnmt-1基因，转染Hela、H1229、C-33A、U-2OS细胞，结果显示siRNA对目的基因的抑制作用均在86%以上。
2 研究信号传导通路的新途径
联合利用传统的缺失突变技术，RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系，Clemens等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径，取得了与已知胰岛素信息传导通路*一致的结果，在此基础上分析了DSH3PX1（Dock　src homology 3 phox 1）与DACK（Drosophila activated Cdc42 tyrosine kinase）之间的关系，证实了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶。
3 新药物的研究和开发
RNAi还可以作为寻找新的药物靶标的工具，可以高通量地发现药物靶基因，帮助新药物的研究和开发，了解药物作用的生化模式等。Makimura等利用RNAi技术减少了丘脑下部AGRP（agouti-releted peptide）50%的表达量，AGRP使代谢率提高而不减少摄食量，从而减轻肥胖，为肥胖的治疗提供了一个靶点。美国Genetica公司已将RNAi技术作为高通量药物靶标识别和确认的工具。
4 基因治疗
RNAi只抑制致病基因，而不影响正常等位基因的功能，具有较高的选择性和特异性，能减少非特异作用引起的副作用。
4.1 治疗病毒感染
可将RNAi视为一种与免疫系统类似的防御机制，利用RNAi技术进行病毒感染的干扰实验已在植物及低等生物中取得满意的结果，但在人体细胞内的实验才刚刚起步。已有研究表明，用siRNA抑制HIV的某些基因，如p24、vif、nef、tat或rev可阻碍HIV在细胞内复制；抑制HIV的受体CD4和CD8a或辅助受体CXCR4或CCR5或病毒结构Gag蛋白表达可阻碍HIV感染细胞。所以应用siRNA可能成为防止HIV-1感染的一种有效手段。Hamasaki等构建的siRNA特异性表达载体与HBV病毒DNA共转染人肝癌细胞HuH7和HepG2，降低了RNA及其复制中间体的水平，并引起HBeAg分泌的下降。zui近，Song等通过RNAi技术使Fas基因沉默，成功地在自身免疫性肝炎小鼠模型中预防了肝衰竭和肝纤维化。
4.2 治疗肿瘤
肿瘤发生是多基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能*抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时沉默的效应，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时沉默。Cioca等利用粒细胞白血病细胞系研究了Raf-1 和bcl-2基因在白血病中的作用，表明RNAi能诱导细胞凋亡并能提高肿瘤细胞对化学治疗的敏感性。Zhang等将针对鼠源VEGF（Vascular Endothelial Growth Factor）各亚型基因的siRNA构建成的RNAi表达载体，均特异性抑制了各亚型VEGF的表达，有效的抑制了肿瘤细胞的生长。β-连环蛋白和APC基因是Wnt信号通路中的重要组分，突变后引起细胞异常增殖，在肿瘤的发生中起重要作用。Verma等利用RNAi技术使这两个基因表达降低，在细胞和裸鼠中都能抑制肿瘤细胞的增殖。以erbB1、端粒酶为靶点，利用RNAi技术抑制肿瘤的研究也取得了满意结果。
5 其它应用
RNAi还可用于细胞周期调控、代谢、膜转运以及DNA损伤反应、转录或甲基化等多种方面的基因功能研究。研究发现，用RNAi技术阻断Ｎrdp1（为ErbB3成员）、BRUCE（为一个530kDa的膜相关凋亡蛋白抑制因子）、Chk1、Wee1和Myt1等进一步解释了细胞凋亡的机制，其中BRUCE通常可抑制凋亡，而Ｎrdp1在凋亡初始阶段起到特别重要的作用。

RNAi相关术语

1.RNAi ：（RNA interference）RNA干扰

一些小的双链RNA可以、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi ，也译作RNA干预或者干涉）。它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。

2.siRNA：（small interfering RNAs）小干扰RNA

一种短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径（RNA interference pathway）。

3.shRNAsRNA-Short hairpin RNAs）短发夹RNA

是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，短发夹RNA能够通过RNA干扰来抑制基因的表达。Thomas Rosenquist's group和Greg Hannon's group联合研究了在哺乳动物种系细胞中shRNAs的转移导致基因长时间稳定沉默的机制。

4.bpBase Pair）碱基对

两个碱基（A和T，或者C和G）之间靠氢键结合在一起，形成一个碱基对。DNA的两条链就是靠碱基对之间的氢键连接在一起，形成双螺旋结构。

5.Base sequence:碱基序列

DNA分子中碱基的排列顺序。

6.Base Sequence Analysis:碱基序列分析

分析出DNA分子中碱基序列的方法（这种方法有时能够全自动化）
cDNA：参见互补DNA。

7.cDNA：互补DNA

以信使RNA为模板合成的DNA，常常采用互补DNA的一条链作为绘制物理图谱时的探针。

8.Complementary sequence：互补序列

以一条核苷酸链为模板，根据碱基互补规则形成的互补链，称为该模板的互补序列。

9.Genomic Library：基因组文库

对某个染色体，制备随机产生的、相互之间有重叠部分的片段的克隆。

10.RISC：（RNA-induced silencing complex）RNA诱导沉默复合物

在RNAi 效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物。激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割mRNA（3, 18, 27, 29）。尽管切割的机制现在还是未知，研究表明每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。

11.Dicer：Dicer酶

RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，能以一种ATP依赖的方式逐步（processive）切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19—21bp的双链RNAs（siRNAs），每个片断的3'端都有2个碱基突出（27, 28）。

12.PTGS：（Post-transcriptional Gene Silencing ,PTGS）转录后基因沉默

部分的植物中的基因沉默是在转录后发生的。它是相对于部分植物中发生的转录阶段的基因沉默（TGS）而言的。

13. TGS：（transcriptional gene silencing）转录阶段基因沉默

14.gene silence:基因沉默

研究结果发现有大量的转基因植株不能正常表达，通常这并不是由于转基因的缺失或突变引起的，而是基因失活的结果.这种失活的现象称为基因沉默。

15.RNA transfection：RNA转染。

16.Sense RNA：正义链RNA

17.Antisense RNA：反义链RNA。

18.19 2 2 nt siRNA：

在细胞中双链RNA一般都被切割成21-23小片段，这样的RNA片段能达到更好的RNAi 作用。人工合成的siRNA也是依据这个原理，所合成的RNA就是19nt的碱基序列再加上两端的识别序列如-GG，-TT等。

19.SECssiRNA expression cassettes）siRNA表达框架

一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。

20.Homologies：同源性

指同种类不同个体或者不同种类个体之间的，染色体或者蛋白质序列的相似性

21.Homologous Chromosome：同源染色体

一对染色体，分别来自父本和母本，染色体上有着相同的线性基因序列。

22.Recombinant Clone：重组克隆

将不同来源的DNA片段合成在一个DNA分子中，这种技术称为重组，得到的分子为重组克隆。

23.Ribonucleic acid：核糖核酸RNA

从细胞的细胞核和细胞质部分分离出来的化学物质。在蛋白质合成和其他生化反应中起着重要作用，RNA的结构和DNA的结构类似，都是有核苷酸按照一定顺序排列成的长链。RNA可以分为信使RNA、转运RNA、核糖体RNA以及其他类型的RNA。

24.rRNA：（RNARibonsomal RNA，核糖体）

存在于核糖体中的RNA。

25.Ribonsome：核糖体

细胞质中含有rRNA和相关蛋白质的细胞器，是蛋白质的合成场所。

26.Transformation：转化

将外源DNA整合到某一细胞基因组中的过程。

27.Entrez：

美国国家生物技术信息中心所提供的在线资源检索器。该资源将GenBank序列与其原始文献出处链接在一起。

28.NCBI：（National Center for Biotechnology Information）美国国立生物技术信息中心

为美国国家医学图书馆（NLM）和国家健康协会（NIH）下属部门之一，1988年设立。主要提供生物医学领域的信息学服务，如世界三大核酸数据库之一的GenBank数据库，PubMed医学文献检索数据库等。

29.GenBank：NIH的基因序列数据库

是所有公开的DNA序列的集合 （ Nucleic Acids Research 1998 Jan 1;26（1）:1-7）. 截至1998年12月，GenBank大约收集了 2,162,000,000 个碱基、3,044,000 个序列。

30.Ribosomal RNA：（核糖体RNA，简写为rRNA）

是一组存在于核糖体中的RNA分子。

31.UniGene：

美国国家生物技术信息中心提供的公用数据库，该数据库将GenBank中属于同一条基因的所有片断拼接成完整的基因进行收录。

32.BLAST:（Basic Local Alignment Search Tool）基本的基于局部对准的搜索工具

一种快速查找与给定序列具有连续相同片断的序列的技术。是一个序列比对Alignment应用程序。它可以在线选择服务器上的数据库进行序列比较包括DNA/DNARNA/DNA蛋白/蛋白序列比对序列比对的作用很多如同源核酸或蛋白序列的查找引物或探针特异性分析物种进化树的构建等等目前多数和软件均提供免费的BLAST的本地或在线检索比较的提供序列比对服务有NCBI的BLAST检索如果需要详细了解这个程序可到http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/去具体看一看帮助文件但是上NCBI需要代理国内的朋友可通过上海生科院的生物信息中心进行BLASThttp://bioinfo.biosino.org:8888/blast/ 速度不错

33.RT-PCR:逆转录PCR

RT-PCR是以RNA为起始材料经逆转录反应产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获取目的基因或检测基因表达。

34.DNA印迹杂交:（DNA blot hybridization）有两种核酸印迹法：

• 将DNA或RNA溶液直接点样于硝酸纤维素膜或尼农膜上（斑点或狭线印迹）
• 经琼脂糖凝胶电泳将片段的DNA或RNA转移到膜上（Southern和Northern印迹法）。DNA在电泳前先用限制性内切酶消化。

35.RNA印迹杂交:（RNA blot hybridization）

RNA印迹杂交是一种检测已固定在滤膜上的总RNA或mRNA特定靶序列的技术。

36.RNA酶控制：

在实验中前期的质粒的构建和提取是要用到RNAse A这种酶的存在会降解后期要转录生产的RNA 如果前期出现了这个酶的污染就会导致后期实验的失败，而后期转录是又要用到其他的RNA酶，如RNA 聚合酶3等，因此在实验中严格控制好RNA酶是RNA实验的关键，具体的做法是做到DNA，RNA移液器的，DNA实验室和RNA实验室的物品和器械分开使用，将实验室中的任务污染源减少至zui低。 

RNAi技术关键问题

低等生物对dsRNA或siRNA导入的条件要求较低，成功率较高，但对较的哺乳动物和人类细胞株的转染成功率却不理想。哺乳动物的细胞对dsRNA的导入具有抗拒性，并且值得注意的是大于30bp 的dsRNA导入哺乳动物细胞可诱导干扰素的合成结果是非特异性的和全面的抑制基因表达，zui终导致细胞凋亡；同时dsRNA具有浓度依赖性，dsRNA诱发的RNAi效应的强度随着其浓度的增高而增强，但是浓度过高RNAi效应也会降低等。RNAi在哺乳动物中的实验遇到的另一问题是RNAi衰减现象，siRNA被导入细胞后RNAi效应仅持续数天便逐渐消失。此外RNAi技术和反义RNA技术一样，有一些如寡聚核酸合成困难、易被降解、导入困难等相似的缺点。
（1）dsRNA序列的选择dsRNA主要选自已知的cDNA的开放阅读框架（ORF）中的基因区域。为防止mRNA调控蛋白对RISC与靶RNA结合的干扰，应避免选择包括:1）起始密码子下游或终止密码的50～100核苷酸位置以内的区域；2）5′或3′端的非翻译区域；3）内含子区域。此外，序列选择时也应避开多聚鸟苷酸序列区（≥3个），因为这样容易形成四聚体结构，抑制RNAi作用。选择与靶mRNA上序列互补的21～23个核苷酸长度的片段，以AA开头为佳，因为此法能简化dsRNA合成过程，降低成本，而且合成的dsRNA能更好地抵抗RNA酶的降解。另外，尽量使dsRNA序列中的GC含量接近50%（45%～55%*），高GC含量能明显降低基因沉默的效应。选择前可以搜索BLAST数据库，保证无其他与靶基因同源的基因存在，避免引起对其他相似基因的沉默作用。并不是所有的mRNA均对RNAi敏感。为确保靶基因表达的有效抑制，同时合成两个或以上的针对同一基因的不同靶区域的dsRNA；而且，标记dsRNA正义链的3′端对RNAi现象并没有影响，现有的实验尚未发现mRNA的二级结构对RNAi有任何显著的影响。目前，RNAi技术主要以哺乳动物细胞为对象研究其基因的功能。但>30bp的dsRNA在哺乳动物细胞中会引起干扰素样效应，导致非特异性反应。因而直接选用其下游的产物分子siRNA来代替，达到基因研究的目的。
（2）dsRNA的导入方法不同的生物体可以选择不同的方法。简单生物，如单细胞生物等，可选用电穿孔的方法；较复杂生物可选用dsRNA微注射入生殖细胞或早期胚胎，线虫也能采用肠道或假体腔注射的方法，与微注射相比，RNAi效率上并无显著差别。还有浸泡法、工程菌喂养法、磷酸钙共沉淀法等。若使用的是化学法人工合成的siRNA（正义链和反义链），还要经过退火过程，以双链的形式导入靶细胞。有人提出了以质粒或病毒为载体，通过转导或转染途径，在细胞内以DNA为模板，利用RNA聚合酶Ⅲ，转录为siRNA（直接形成双链或通过回文序列折叠后形成发夹结构），也能产生较明显的RNAi效应。zui近，又有一种新的导入方法，就是借助高压水枪的外力将构建的质粒直接自小鼠的尾静脉注入体内，观察RNAi在活体生物模型而不是培养细胞上的基因沉默效应，但观察到的siRNA的半衰期较短，而且由于使用了高压的外力，过程较复杂，限制了其在人类疾病治疗方面的应用。而Pachuk等则提出了肌注的方法，将针对IL－12的siRNA的质粒表达载体导入小鼠体内，得到的RNAi效应更持久。
（3）发夹样结构的siRNA实验证明，发夹样siRNA能延长在细胞内的作用时间。此类结构可由具有回文序列的核苷酸链形成。但通常回文结构不易获得，也可用头碰头的对称序列来代替。转录发夹样siRNA的模板必须与载体转录启动子紧密相连，而且尽可能有zui短的多聚腺苷酸尾巴，这样才能诱导的RNAi效应。Paddison等提出类似的结构也可应用于长片段dsRNA（500bp左右），而不会引起RNA非特异性的降解。这为检测哺乳动物细胞中经过长期发育后的基因功能提供了新的途径。

RNAi抑制病毒研究技术路线

RNAizui主要的作用是一小段（大约21-23bp）的双链RNA分子（double-strainded RNA,dsRNA）它介导细胞内序列特异性基因表达阻断或封闭，也就是转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）,从而起到控制细胞的各种生命活动。
1. RNAi的作用水平
RNAi是在多重水平上发挥作用的。zui先在华丽新小杆线虫中发现，dsRNA所诱导的基因沉默在转录后水平，因为dsRNA导致了相应RNA（mRNA）的降解，而基因启动子和内含子序列作为基因沉默触发物则无效。后来在植物中也发现，RNAi引起的基因沉默也是在转录后水平。
除此转录后水平降解mRNA的机制外，RNAi还通过其他机制来影响基因表达。在植物中，dsRNA导致基因组中与沉默触发物同源序列的甲基化；如果与沉默触发物与启动子序列相同，则引起转录水平的基因沉默 。而另外的研究还发现，在华丽新小杆线虫中，RNAi装置中，内源性编码的诱导剂，是在蛋白质合成水平发挥作用的。
2. RNAi的作用的基本过程
*步：起始步  沉默触发物被裂解，产生小干扰性RNA（small interfering RNAs，siRNAs）。研究表明，果蝇胚胎提取物就有将长链dsRNA底物裂解为长度在约22bp小片段的活性。这些siRNAs是双链的，有磷酸化的5ˊ端。这一过程，可能与Rnase Ⅲ家族的功能有关。该家族中有一类已被命名为Dicer酶，含2个催化结构域、1个螺旋酶结构域和1个PAZ基序。遗传学研究表明，Dicer酶结构在多种生物体之间比较保守。
第二步：效应步  siRNAs与多种亚单位形成复合物—RNA诱导的沉默复合物（RISC），然后以RISC的方式降解单链的靶mRNA。在RISC中，这种大小约22bp的siRNAs所起的作用，是以碱基配对的原则，识别与dsRNA相同序列的靶mRNA，引导复合物中的RNA降解酶RNase，确保对特定的序列的靶mRNA进行降解。
第三步：沉默效应的放大和扩散  在华丽新小杆线虫中，RNAi能够扩散到整个虫体，即使只有少量的触发物dsRNA；在植物中也发现了相似的情况，沉默效应扩散到整株植物，并可转移到嫁接的幼芽。研究发现，西红柿中RNA指导的RNA聚合酶（RdRP）与RNAi的扩散有关；而华丽新小杆线虫和植物中dsRNA诱导的基因沉默所需要参与的蛋白质，在序列上与西红柿的这种RdRP很相似；在其他生物体中，起RdRP作用的分别可能是：拟南芥属—SDE1/SGS2，脉孢菌属—QDE-1，胚系华丽新小杆线虫—EGO-1，华丽新小杆线虫成虫—RRF-1/RDE-9；而病毒诱导的基因沉默（VIGS），则是螺旋酶。有学者认为，沉默效应的放大和扩散，是RdRP激发了另外的dsRNA合成。

哺乳动物细胞的RNAi技术策略

一、靶siRNA序列选择

靶siRNAA序列选择是RNAi实验成败的关键。哺乳动物细胞RNAi实验中，使用zui广泛且zui有效的是21bp siRNA。siRNA由正义链和反义链组成，两条链3’端均有2个碱基突出，一般为UU或dTdT，其中正义链的前19nt与靶基因序列相同。

1. siRNA设计的原则
SiRNA双链设计时，一般在靶mRNA起始密码下游100—200bp至翻译终止密码上游d0—100bp的范围内搜寻AA序列，并记录每个AA3’端相邻19个核苷酸作为候选si.RNA靶位点。其中AA（N19）TT是的序列，若靶mRNA中无此序列，亦可选用NA（N21）或NAR（N17）YNN（R表示嘌呤，Y表示嘧啶），但在合成时，siRNA的正义链3’端需用dT—dT代替。TuscRl等建议设计的siRNA不要针对mRNA的5’和3’端非编码区，因为这些区域有丰富的调控蛋白结合位点，而UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP（siRNA protein complex，核酸内切酶复合物）结合mRNA，从而影响siRNA干扰的效果。zui后还应将候选siRNA序列在GenBank进行BLAST检索，与非同源基因具有3个或3个以上碱基相异的序列方可选用。

2. siRNA的序列结构特征
除了靶序列位点的选择，siIRNA序列本身结构特征亦会影响到RNAi效率。RNAi实质上可视为一个RNA与蛋白质互作过程，包括siRNA与RISC结合、RISC的激活以及RISC与靶mRNA的结合和切割，这种互作效应的存在，往往造成siRNA链的选择具有偏爱性。Reynolds等通过对2个基因的180条siRNA序列分析，归纳出以下8个与
siRNA性相关的特征:G/C含量低（30%-52%），正义链3’端具较低稳定性（有利于siRNA与RISC的结合和解链），无反向重复序列（有利于减小siRNA的有效作用浓度，提高siRNA干扰效率），正义链碱基的偏爱性A19（正义链中第19位碱基为A，如下表示类同）；A3；U10；无G/C（正义链中第19位碱基不为G或C）；无G13。依此规则，Reynolds等设计的30条siRNA中有29条是有效的。Kumiko等亦认为siRNA反义链5’端为A/U（即有义链U/A）19和zui后7个碱基中有5个A/U，会有助于RNAi的发挥，且正义链G/C1和序列中无连续9nt以上的GC重复片段与基因沉默效率呈显著相关。有趣的是，该实验还表明这些规则同样适用于DNA介导的RNAi（DNA-based RNAi.）实验。此外，Amarzguioui等发现正义链5’与3’端的前3个碱基中A/U含量不对称（3’端含量应高一些）和A6对siRNA 的活性亦影响很大。根据上述结果，可以初步绘制出一个siRNA序列结构的精细与简略示意图。

现已知道siRNA的反义链决定着靶位点识别，那么在不影响siRNA作用功效的前提下，是否可以对其正义链碱基作适当更改或修饰呢？Amarzguioui等研究siRNA不同部位对碱基突变和化学修饰的耐受性，认为siRNA的5’端相对于3’端具有对突变的较高耐受性。有学者认为正义链3’突出端的任何碱基修饰对siRNA作用效果均无明显影响。还有学者认为与反义链互补的正义链3’端发生1—4个碱基的错配反而有助于增强RNAI的活性。

二、siRNA制备方法

目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括

化学合成
体外转录
长片断dsRNAs经RNase III 类降解 （e.g. Dicer, E. coli, RNase III）
siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs
PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达

三、siRNA的转染

将siRNA、siRNA表达载体或SECs导入哺乳动物细胞中是诱导RNAI发生的关键。有许多转染试剂可供选用，zui常用的是脂质体转染试剂。某些情况下电穿孔法亦可用，但易导致较高的细胞毒性反应。对于同一细胞系，使用不同的转染试剂或方法，其效率往往会有所不同；而对于不同的细胞系，使用同一种转染试剂或方法，效果亦会不同。因此在实验过程中，有必要尝试多种试剂或方法来确定*条件。转染效率可通过测定细胞的密度，转染的时间和siRNA与转染试剂的比例来评价。

四、实验对照设置

实验对照是衡量RNAi.实验数据可信度的一个重要因素。设立阳性对照目的是通过检测不同浓度的siRNA转染效率及其zui终干扰效果，来确定合适的转染条件和zui低有效的SIRNA浓度。有实验表明RISC复合物具有饱和性，且过多siRNA会导致细胞毒性和死亡。对于大多数细胞，持家基因（如GAPDH，c-cmyc, β—acion等）是较好的阳性对照，针对这些基因的SIRNA序列已有报道。阴性对照是用来检测RNAi的特异性。通常作为阴性对照的siRNA与选中的siRNA序列有相同碱基组成，但与靶mRNA无明显同源性。阴性对照的siRNA序列设计有2种方法，一是将特异性siRNA的序列打乱，即“零乱”siRNA（scrambled siRNA），再对其进行BLAST比对，防止与目的靶细胞中的其他基因有同源性；另一种是在特异性siRNA中引入几个错配碱基。若引入的是一个碱基错配，应需考虑它与突变mRNA（即SNP位点）结合能力，在设计siRNA时就避免SNP区。

五、RNAi效果检测

RNAi效果可从mRNA和蛋白质两个水平来进行量化。在mRNA水平上，Northern Blot和实时定量PCR是两种常用方法。值得注意的是在进行实时定量PCR时，cDNA合成要用oligo（dT），而不是随机引物，且预扩增片段位于靶mRNA序列中siRNA位点的上游。蛋白质水平可以通过Western Blot、荧光免疫检验法、流式细胞分析术和表型分析来检测。RNAi一般在转染后24小时内发生，其引发基因沉默的程度和持续时间依赖于靶蛋白质的降解率（turnover rate of the protein）、siRNA在细胞内的寿命以及其逐渐被稀释的程度。

RNAi实验方法

（一）siRNA的设计
1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下进行目标序列的筛选：
http://www.genesil.com/business/products/order2.htm
http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html
http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html
http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710
2.RNAi目标序列的选取原则：
（1）从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。
Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
（2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。
例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
（3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到zui有效的siRNA序列。
3.阴性对照
一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。
4.目前已证实的siRNA可以在下面的网页找到：
http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49
http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.html
http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html
http://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published
（二）siRNA的制备
目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsRNAs经RNase III 类降解 （e.g. Dicer, E. coli, RNase III）体外制备siRNA，以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。

体外制备
1.化学合成
许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出zui有效的序列再进行化学合成。
zui适用于：已经找到zui有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究
不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素
2.体外转录
以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。
zui适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。
不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。
3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III （or Dicer） 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
zui适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗

体内表达
前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。
4. siRNA表达载体
多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子（pol III）中的一种，操纵一段小的发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
zui适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。
5. siRNA表达框架
siRNA表达框架（siRNA expression cassettes，SECs）是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的zui有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的zui适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的zui有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中（晶赛公司的Protocol可以解决这一问题）②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。
zui适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选*启动子
不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）
（三）siRNA的转染
将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：
1.磷酸钙共沉淀
将氯化钙，RNA（或DNA）和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离*条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
2.电穿孔法
电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
3.DEAE-葡聚糖和polybrene
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖于瞬时转染。
4.机械法
转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
5.阳离子脂质体试剂
在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。
为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：
1.纯化siRNA
在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。
2.避免RNA酶污染
微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性
通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。
4.避免使用抗生素
Ambion公司推荐从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到*转染效果。
5.选择合适的转染试剂
针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。
6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件
对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。
7.通过标记siRNA来优化实验
荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。

设计siRNAs的方法

关于设计siRNA以及siRNA设计对siRNA功能的影响，至今还没有可靠的规律。虽然我们可以通过对mRNA实验分析准确的找到一段基因的全部siRNA*作用位置，但这个过程十分耗时且昂贵，不推荐常规实验使用。一种做法是每个目标序列设计3－4对siRNAs，实验选择较有效的siRNA。
 
目前，siRNA设计大都根据Tuschl的实验，要点如下：
1.目标基因开放阅读框起始密码下游75至100碱基位置开始，寻找“AA”二连序列后的19个碱基序列。（用非“AA”的“XY”序列后的19个碱基序列同样可以得到很好效果的siRNA）。 设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区。
2.分析获得的序列，选择GC比在40-55%之间的靶基因序列作为优选。
3.将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST等。
4.如果您选择shRNA，有报道显示9个寡核苷酸的环是zui有效的。

下面是另一个设计的版本，大致相同：
1.  从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
2.  将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST 
3.  选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到zui有效的siRNA序列。

负对照
一个完整的siRNA实验应该有负对照，作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。 如果计划合成siRNA，那么可以直接提供以AA打头的21个碱基序列，厂家会合成一对互补的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT结尾，如果要UU结尾的话通常要特别说明。有结果显示，UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别。因为这个突出端无需和靶序列互补。

制备siRNAs的方法

越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）来抑制特定的哺乳动物基因表达。siRNA是一种短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径（RNA interference pathway）。RNAi的应用包括功能基因组学，药物靶筛选，细胞信号传导通路分析等等。
目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括
• 化学合成
• 体外转录
• 长片断dsRNAs经RNase III 类降解 （e.g. Dicer, E. coli, RNase III）
• siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs
• PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达
前面3种方法包括体外制备siRNAs然后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞后面两种方法则依赖能够表达siRNAs的DNA载体或者表达框转染到细胞中。每种方法都有自己的优点和缺点。哪种是的方法，其实取决于实验目的。这里简单介绍这5种方法，优点和缺点，以及它们的应用。

siRNA的设计

除了方法3以外，其他的方法都在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列。关于怎样设计siRNA以及siRNA设计对siRNA功能的影响，尽管我们不断掌握越来越多有关设计原则的信息。但这仍然不是的。通常来说，每个目标序列设计3—4对siRNAs，在后面的实验中选择zui有效的那个。网上有提供免费的siRNA设计工具。
体外制备
1.化学合成
尽管化学合成是zui贵的方法，但是却是zui方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出zui有效的序列再进行化学合成。
zui适用于：已经找到zui有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究
不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素
2.体外转录
通过体外转录的方法可以合成siRNAs，这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。以Silencer  siRNA Construction  Kit为例，一旦得到DNA Oligo模版（这个还是需要DNA合成的，不过DNA合成的成本就比较低了），只要24小时就可以，不需要等很久。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间——毕竟，化学合成只需要定购就可以了。值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果（0.5-20 nM vs. 50-100 nM  per transfection）
zui适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。
不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。

siRNA的转染的方法及其注意事项

将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：
1.磷酸钙共沉淀
将氯化钙，RNA（或DNA）和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离*条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。

2.电穿孔法
电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。

3.DEAE-葡聚糖和polybrene
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖于瞬时转染。

4.机械法
转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。

5.阳离子脂质体试剂
在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。

为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：
1.纯化siRNA
在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。

2.避免RNA酶污染
微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。

3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性
通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。

4.避免使用抗生素
Ambion公司推荐从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到*转染效果。

5.选择合适的转染试剂
针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。

6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件
对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。

7.通过标记siRNA来优化实验
荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。

siRNA对照解析

A．普通阴性对照 
1.siRNA实验应该有阴性对照；
2.通用阴性对照为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照；
3．Scrambled阴性对照和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性；
4．阴性对照需要确定和目的靶细胞中其它基因同源性很低。
 
B．荧光标记阴性对照 
1. RNAi negative control与哺乳动物基因无同源性；
2.通过标记荧光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染情况；
3.可用于优化转染条件和评价转染效率；
4.具备很好的pH耐受性，在活细胞中更稳定。
 
C．siRNA阳性对照 
阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。您可以利用阳性对照来确认RNAi实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法是可靠的。
siRNA阳性对照较为常用的如下：
1  LaminA/C
2  GFP22
3  Luciferase GL2
4  MAPK1
5  Beta-Actin
6  Vimentin
7  P53
8  GAPDH
9  Cyclophilin B
   
D．转染试剂对照 
对于一个完善的对照系统，转染试剂对照（Mock transfection ）是*。转染试剂对照可以检测转染试剂对细胞的毒性、细胞的成活率等细胞转染的各个因素影响。
 
E．避免Off-target对照
对于RNAi研究来说，在哺乳动物中，off-target效应是一个十分关注的问题。有大量的报道，一个siRNA影响多个基因的表达。因此，大量研究关注于用针对同一个基因的不同区域的多个siRNA进行实验，然后分析各自对基因表达效果的影响。理想的结果是针对不同区域的siRNA对同一个靶基因产生相似的干扰效果。

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