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2019/4/12 10:13:36Low-Level DNA Detection
1.smMIP
单分子分子反转探针
smMIP方法使用单分子标记和分子反转探针来检测和量化低频率发生的遗传变异 (Hiatt等,2013)。在该方法中,探针用于检测gDNA中的靶标。在复制探测的靶标后,外切核酸酶消化使标记物离开靶标,随后进行PCR扩增。测序允许靶标的高分辨率序列读取,而更大的深度允许更好地比对每个*的分子标签。
好处:
检测低频目标
可以对原料有限的样品进行单细胞测序或测序
临床样本中 每碱基误差为2.6×10 -5 (Eboreime等,2016)
缺点:
PCR扩增错误
PCR偏差可以代表富含GC的模板
在PCR期间,聚合酶优先扩增小于500bp的靶标
2.MIPSTR
smMIPs有针对性地捕获STR基因座
MIPSTR是一种对许多个体的种系和体细胞短串联重复(STR)变异进行多重基因分型的方法(Carlson等,2015)。该方法是smMIP (Hiatt等,2013) 方法的变体, 并使用新颖的映射策略。
该方法使用具有共同主链的smMIP用于PCR引物,测序衔接子,12bp简并标签和具有基因座特异性和STR侧翼序列的靶向臂。捕获遗传多样性的个体可识别种系STR变异。使用简并标签识别技术变异,并且跨标签定义的读取组的STR变化被认为是体细胞变异。
好处:
能够区分技术错误与体细胞STR突变
缺点:
需要高质量的参考基因组
3.MDA
多位移放大
MDA是一种常用于测序微生物基因组的方法,因为它能够扩增大于0.5 Mbp的模板,但它也可用于研究其他大小的基因组 (Dean et al。,2001)。在该方法中,3'封闭的随机六聚体引物与模板杂交,然后用Phi 29聚合酶进行链置换DNA合成。该方法允许有效和快速的DNA扩增。扩增DNA的深度测序提供了读数的准确表示,而测序深度为序列提供了更好的比对和共识。原始MDA方法的几种变体,如MIDAS (Gole等,2013),ddMDA (Rhee等,2016),SNES (Leung等,2015)和IMS-MDA。(Seth-Smith等,2013)已经开发出来以改善扩增偏差和通量 (Seth-Smith等,2013)。
好处:
模板可以是环状DNA(例如,质粒,细菌DNA)
可以对大模板进行排序
可以对有*原料的样品进行单细胞测序或测序
缺点:
强放大偏差; 基因组覆盖率低至约6% (Navin et al。,2011)
PCR偏差可以代表富含GC的模板
受污染的试剂会影响结果 (Woyke等,2011)
4.MALBAC
多次退火和循环放大的放大周期
MALBAC旨在解决MDA的一些缺点 (Zong等,2012)。在该方法中,MALBAC引物随机退火至DNA模板。在升高的温度下具有置换活性的聚合酶扩增模板,产生半胱氨酸。“随着扩增和退火过程的重复,半胱氨酸扩增成全扩增子,其末端与5'末端互补。结果,全扩增子末端杂交形成环状结构,抑制环状扩增子的进一步扩增,而只有半缩样子和gDNA经历扩增。全扩增子序列的深度测序允许准确表示读数,而测序深度为共有序列提供改进的比对。该方法也可以应用于cDNA用于转录组分析 (Briese等,2016)。
好处:
可以对大模板进行排序
可以对有*原料的样品进行单细胞测序或测序
全扩增子环化抑制模板的过度表达,减少PCR偏倚
可以扩增富含GC的区域
提供统一的基因组覆盖
与MDA相比,等位基因丢失率较低
缺点:
与Phi 29相比,聚合酶相对容易出错 (Gole et al。,2013)
温度敏感协议
提供高达约90%的基因组覆盖率 (Lovett等,2013),但基因组的某些区域的代表性不足(Lasken等,2013)
5.NUC-SEQ / SNES
S期/单核外显子组测序中细胞的单个G2 / M核测序
修改的MDA方案nuc-seq利用了细胞周期的G2_M阶段中的单个细胞具有4个拷贝的基因组的事实。该特性允许细胞用细胞分选仪分离,并且它还显着增加单细胞的基因组覆盖度 (Wang等人,2014)。SNES是一种额外的变异,包括外显子组的靶向选择和测序 (Leung等,2015)。Div-Seq是一种变体,它将nuc-seq与5-乙炔基-2_-脱氧尿苷(EdU)的增殖细胞脉冲标记相结合, Habib等,2016)
好处:
nuc-seq:将单细胞测序的物理覆盖性能提高到90%以上
SNES:单细胞中外显子组覆盖率为95.94%
SNES:同基因群体中SNV的检测效率为92.37%
缺点:
nuc-seq:不适用于低增殖率的细胞
SNES:限于外显子组
6.OS-Seq
寡核苷酸选择性测序
开发OS-Seq是为了通过直接在流动细胞上捕获和测序基因靶标来改进靶向重测序 (Myllykangas等,2011)。在该方法中,使用具有衔接子的靶序列来修饰流动细胞引物。使用修饰的引物将模板中的靶标捕获到流动池上。进一步延伸,变性和杂交提供靶基因的序列读数。深度测序提供准确的读数表示。
好处:
可以一次重新排序多个目标
无需凝胶切除或窄尺寸纯化
快速,单日协议
样品可以多路复用
由于去除了扩增步骤,降低了PCR偏差
避免材料损失
缺点:
引物可以与相似的靶序列相互作用,导致序列模糊
7.Duplex-Seq
双工序列
Duplex-Seq是一种基于标签的纠错方法,可提高测序准确度 (Schmitt等,2012)。在该方法中,将衔接子(具有引物序列和随机的12bp索引)连接到模板上并使用PCR扩增。深度测序提供来自每个*分子标签的共有序列信息。基于分子标签和测序引物,对齐双链体序列,确定每条DNA链上的真实序列。估计该方法比传统NGS准确度高10,000倍 (Ahn等,2015)。双重测序的目标版本包括2轮捕获,读取深度高达1,000,000x (Schmitt等,2015)
好处:
可以检测> 10 7个测序核苷酸中的单点突变(Schmitt等,2012),(Schmitt等,2015)
双工标记导致错误率极低
可以检测PCR扩增错误并从分析中除去
添加适配器后无需额外的文库准备步骤
缺点:
复杂的文库构建(Stahlberg et al。,2016)