实验背景
细胞三磷酸腺苷(ATP)的产生速率是一种描述细胞代谢的信息含量很高的测量，因为
ATP是细胞内普遍存在的主要能量货币。细胞的代谢调控使细胞根据ATP需求的变化调整ATP产生的变化来维持总的细胞内的ATP水平。
安捷伦Seahorse XF实时ATP速率测定被设计用来测量活细胞总的ATP产生速率。更重要的是，这个实验能够区分哺乳动物细胞内两条主要的产生ATP的代谢途径线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解ATP的产生。
常见问题
如果检测液中含有不同的氧化底物（不同的P/O值），mitoATP产生速率如何计算？
为了将ATP偶联的呼吸转换为线粒体的ATP产生速率，在电子传递链末端每还原一个氧原子，ADP磷酸化为ATP的化学计量学必须得到确定。不同的底物理论上最大的P/O值不同，并且依赖于化学计量学/底物氧化通路，以及F1F0 ATP合酶的效率。在标准的XF实验条件下，细胞被供给底物混合物（主要是葡萄糖，丙酮酸和谷氨酰胺），且通常内源性底物储备（糖原，脂肪酸，其他氨基酸）可用于线粒体氧化。因此，用几种细胞系进行了测试并确认P/O值2.75准确代表了外源性和内外源性氧化底物混合物的平均P/O值。
当进行诱导的XF实时ATP速率测定时，诱导的速率是如何计算和报告的？
在XF实时ATP速率诱导实验中Summary Printout和Measure Sheet中的 Average Assay Parameter Calculations显示的Induced Rate(s)是用急性注射和寡霉素注射之间所有测量的平均值计算的。然而，每个时间点的诱导速率可以从Kinetic Rate Data（Measure Sheet）中获得。
XF实时ATP速率测定中定义的XF ATP速率指数是什么？
XF ATP速率指数是mitoATP产生速率与glycoATP产生速率的比值（即mitoATP rate/glycoATP rate）。这个比值是一个细胞代谢表型的定量指标。代谢指数大于1代表大于50%的细胞ATP来自线粒体的ETC/氧化磷酸化，而指数小于1表示大于50%的总ATP是糖酵解途径产生的。因为代谢指数是比值测量，所以它对于代谢表型的改变或转换是高度敏感的。
为什么相同的细胞类型当细胞以不同的密度种板时XF ATP速率不一样？
细胞的代谢表型会被细胞对ATP的需求所影响。一般来说，处于增殖或分化中的细胞比融合（缓慢生长）或末端分化的细胞拥有更高的糖酵解速率。为了比较实验之间的结果，推荐在整个研究过程中保持一致的细胞培养条件和细胞接种密度。
为什么必须用Seahorse XF DMEM培养基，pH 7.4或Seahorse XF RPMI培养基，pH 7.4来进行这个实验？
GlycoATP产生速率的计算需要对XF实时ATP速率测定中的糖酵解质子流出速率进行绝对测量。为了正确计算PER，检测液必须要有一个固定的缓冲能力。培养基中低浓度的HEPES 在实验的时间范围内提供了一致的缓冲能力值。虽然添加HEPES缓冲液轻微地减少了ECAR信号，但是它显著提高了ECAR数据的质量和一致性，以及转换为PER的准确性（更多详情，请参阅White paper: Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology）。此外，使用预调pH到7.4的XF DMEM或XF RPMI培养基节省了实验准备的时间，确保XF实验过程中一致的检测液pH值。
我能够使用其他的Seahorse XF检测液来运行XF实时ATP速率测定吗？
GlycoATP产生速率的准确计算需要使用一种没有酚红和碳酸氢钠且低浓度HEPES缓冲液的检测液。因此，强烈推荐使用安捷伦Seahorse XF DMEM（或RPMI），pH 7.4的培养基。任何偏离推荐的培养基和补充剂（葡萄糖，丙酮酸钠，谷氨酰胺），需要根据经验（使用XF分析仪）确定每个实验的缓冲系数（参阅Seahorse XF Buffer Factor Protocol以进一步了解信息）。任何含有酚红的检测液不能在XF实时ATP速率测定中使用。
当运行诱导的XF实时ATP速率测定时，寡霉素注射之后的OCR高于基础OCR，发生了什么？
在寡霉素注射之前加入的化合物使电子传递与氧化磷酸化解偶联（如FCCP，DNP等等），通常会导致OCR增加。然而，这种呼吸不与ATP的产生偶联，因为没有ATP合酶的参与，线粒体膜电位会减少或消除，所以在这种环境下很少或没有ATP生成。在这些情况下，基础的mitoATP产生速率不能够被准确计算。如果怀疑存在解偶联化合物，那么推荐添加一组对照组，注射检测液+溶剂来计算基础的mitoATP产生速率。
