什么是外泌体
简单介绍⼀下细胞外囊泡（Extracellular Vesicles， EVs）。细胞外囊泡是细胞以多种形式分泌到细胞外的各种囊泡：
其主要分为外泌体（Exosomes）直径为30-150nm，以内吞的形式释放到细胞外；微囊泡（Microvesicles）直径为100-1000nm，以出芽的形式释放到细胞外；凋亡⼩体（Apoptotic body）直径为50-2000nm，由凋亡细胞产⽣。
生理功能：
外泌体是细胞与细胞间通讯中起关键作⽤的胞外基质成分，⼴泛参与细胞间物质运输与信息传递，调控细胞⽣理活动；同时，外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸等免疫调节作⽤和诱导正常细胞转化，促进肿瘤发⽣及转移的作⽤；此外，外泌体还可以作为“天然的纳⽶粒⼦”来进⾏药物递送，装载的药物类型包括⼩分⼦化学药物、蛋⽩质和肽、核酸药物等。
样本来源：
目前外泌体研究的样本主要是以细胞培养上清以及各种体液为主，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等。
分离手段：
外泌体分离的方式方法有很多很多种，这边就比较其相对的优劣势进行简单的比较：
1.差速超速离⼼：差速超速离⼼是⼤家最熟悉的⼀种分离⽅法，⽂献中⽤得最多的且也是⽬前⽐较能受到认可的⽅法。差速超速离⼼是先通过低速离⼼去除细胞和细胞凋亡碎⽚，再通过超⾼速去除⼤囊泡和沉淀外泌体。此⽅法分离得到的外泌体可⽤于后续的鉴定实验、分⼦检测实验、细胞实验和动物实验。
2.密度梯度离⼼：此⽅法多指蔗糖密度梯度超速离⼼。此⽅法从不同密度的颗粒中分离出囊泡，对离⼼的时间⽐较敏感。如果外泌体和颗粒密度相似，外泌体可能会被其他颗粒污染。
3.超滤：超滤过程中需要⽤超滤膜进⾏外泌体隔离。在分离过程中，外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低。同时，外泌体会粘附在膜上，导致产量降低。
4.免疫磁珠法：⽤包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。该⽅法分离得到的外泌体的⽣物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验。
5.试剂盒分离法：⽬前商业化的外泌体提取试剂盒多种多样，提取效果良莠不齐。同时试剂盒本⾝的价格⽐较⾼，且外泌体的得率和纯度⼀般，不是性价⽐⾼的⼀种分离⽅法。
外泌体的鉴定：
外泌体分离之后，需要经过⼀系列鉴定才能确定分离的是外泌体。。下⾯介绍⼏种鉴定⽅法：
1.透射电镜鉴定法：透射电镜，全称为透射电⼦显微镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM），分辨率为0.1~0.2nm，适合外泌体双层囊膜超微结构观察，⽤于鉴定样本中是否存在外泌体样结构，即通常为茶托型或⼀侧凹陷的半球形。
2.浓度粒径检测法：纳⽶颗粒跟踪分析法，简称NTA（Nanoparticle Tracking Analysis），该技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征⼿段之⼀。NTA技术的样本处理简单、能保证外泌体原始状态、检测速度快，检测后能提供外泌体粒径和浓度信息。
3.Western Blot分⼦标志物检测： WB可以⽤来鉴定外泌体的标志蛋⽩是否存在于样本中。外泌体标志蛋⽩包括四跨膜蛋⽩家族，如CD9、CD63和CD81；细胞质蛋⽩，如肌动蛋⽩（Actin）和钙磷脂结合蛋⽩（Annexins）；参与⽣物功能的分⼦，如凋亡转接基因2互作蛋⽩X（ALIX）、肿瘤易感基因101蛋⽩（TSG101）、热休克蛋⽩（HSP70、HSP90），以及细胞分泌的特异性蛋⽩。
4.流式细胞术检测：外泌体可以先进⾏荧光标记，再通过流式细胞仪检测外泌体表⾯标记蛋⽩。但是传统的流式细胞仪检测样本的颗粒⼤⼩是300-500nm，⽽外泌体直接都在300nm以下，因此，可能⼤量的外泌体检测不到，造成分析不太准确。
5.ELISA检测：根据外泌体的表⾯标志物，如CD9、CD63进⾏ELISA实验，来检测外泌体的蛋⽩量，从⽽实现对外泌体的分析。但是ELISA⽅法容易受其他抗原的⼲扰，引起实验结果出现偏差。
外泌体提取下游实验：
1.外泌体microRNA测序/芯⽚：通过对外泌体microRNA的⾼通量分析，可以找到不同外泌体之间差异表达的microRNA，为后续的功能学实验做准备。
2.外泌体mRNA测序/芯⽚：通过对外泌体转录组测序或表达谱芯⽚分析，可以找出不同外泌体之间差异表达的mRNA，从⽽发现外泌体中哪些基因发⽣了变化。
3.外泌体lncRNA芯⽚：通过lncRNA芯⽚可以同时得到lncRNA和mRNA数据，为研究者提供更完整的lncRNA和mRNA筛查。
4.外泌体ceRNA芯⽚：竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）机制如下：microRNA（miRNA）处在调控⽹络的中⼼，lncRNA分⼦富含miRNA结合位点，可以竞争性地结合miRNA，解除miRNA对其靶基因的抑制作⽤，进⽽调控基因的表达⽔平。通过ceRNA芯⽚可以为研究者提供完整的lncRNA，circRNA和mRNA筛查。
5.外泌体蛋⽩质组学：主要包括iTRAQ蛋⽩质组定量/TMT标记定量蛋⽩质组学/label free蛋⽩质组定量。通过蛋⽩质组学分析，寻找差异表达蛋⽩，并揭⽰其细胞⽣理病理功能。
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