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       致病性大肠埃希氏菌的生物学特性与检验方法！

致病性大肠埃希氏菌是指能使人、动物(尤其是婴儿和幼龄动物)感染及人食物中毒的一群大肠杆菌。

在自然界中本菌分布广泛，主要寄居场所是人和其它温血动物的肠道中，是一类条件性致病菌。致病性大肠埃希氏菌的形态特点、培养特性和生化特性均与非致病性大肠埃希氏菌非常相似，以至难以区分，只能通过血清学的方法，从抗原结构的差异来区别。在致病性大肠埃希氏菌中，有些血清型能够引起人的食物中毒，有些血清型能够引起人的肠道内外感染。还有一些血清型的菌株能够使畜禽发病，危害畜牧业，降低畜产食品的质量。致病性大肠埃希氏菌可从饮用水，未消毒牛乳，病畜脏器、禽类及其人畜粪便污染的各种食品中分离出来。

致病性大肠埃希氏菌属主要分为五大类，首先根据发病机理分为三大类，

1、产毒素型大肠埃希氏菌(ETEC)，

2、侵袭型大肠埃希氏菌(EIEC)

3、肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC)

近来又提出另外两类

4、即出血性大肠埃希氏菌(EHEC)

5、肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC)

但是，致病性大肠埃希氏菌的致病性是一个很复杂的问题，也并非由某一方面的因素所决定。

致病性大肠埃希氏菌中，一般认为能产生耐热{ST)和不耐热(LT)肠毒素的两种菌株均可引起人的食物中毒。引起大肠埃希氏菌币毒的主要是一些动物性食品，如乳与乳制品、肉类、水产品等，牛和猪是传播这种病菌、引起中毒的主要原因。

1996年7月在日本就发生了大肠杆菌0157型引起的食物中毒，造成9017多人中毒，10人死亡，其原因与生食萝卜苗有关，其中92例并发出血性肠炎及出血性尿毒症。2001年，再江苏、安徽等地爆发的肠出血性大肠杆菌0157:H7食物中毒，造成177人死亡，中毒人数超过2万人。

如仔猪黄、白痢、猪水肿病、牛腹泻和败血症等均可由大肠杆菌引起。

一、生物学特性

1、形态与染色特性

菌体两端钝圆、中等大小，杆状(有时呈卵圆形)、1—3um X 0.6um、周生鞭毛，能运动，不产生荚膜，革兰氏阴性，而且一般是对碱性染料着色较好，但有时两端着色较浓，要与巴氏杆菌区分开来。

2、培养特性

1）需氧及兼性厌氧菌

2）对营养的要求不高，在普通琼脂上就生长良好，在15C-45℃范围内均可生长，但生长温度为37℃，pH为7.2—7.4。

3）在普通琼脂平板上培养24小时，可形成圆形、凸起、光滑、湿润、半透明、边缘整齐、中等大小的菌落．其菌落与沙门氏菌比较相似，但是，大肠杆菌菌落对光(45角折射)观察可见荧光。

4）在肉汤培养基中生长18～24小时变为均匀浑，而后底部出现粘性沉淀物，并伴有臭味。

5）部分菌落可出现β溶血。

6）在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落

7）在S．S琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌，也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落；

8）在伊红美兰琼脂上形成具有金属光泽的黑色菌落

9）在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色

3、生化特性

1）可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，有些不典型的菌株不发酵或迟缓发酵乳糖；

2）不同菌株对蔗糖，卫矛醇、水杨苷发酵结果不一致。

3）本菌可使赖氨酸脱鞍、不能使苯丙氨酸脱羧。

4）不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素，

5）不能在培养基上生长，靛基质试验阳性，V-P试验阴性，不利用枸橼酸盐。后四项生化特性是典型的大肠埃希氏菌，与此不一致的即为非典型大肠埃希氏菌菌。

IMViC试验：如IMViC试验为+、+、-、-，且乳糖发酵，表明被检物已有粪便污染，有发生肠道传染病的危险，这是卫生细菌中常用的检测指标。（I：吲哚形成试验，M：甲基红试验，Vi：V-P试验，C：枸橼酸盐利用试验）

4、血清学特性

大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。

1）O抗原

成分为细胞壁上的糖、类脂和蛋白质复合物，也是细菌的内毒素，热稳定性较强，高压蒸汽处理2小时不被破坏。每一血清型只含有一种O抗原，本菌已发现有167种O抗原，分别以阿拉伯数字表示。

2）H抗原

为蛋白质；一种大肠埃希氏菌只有一种H抗原，无鞭毛则无H抗原，H抗原能在80度被破坏，也能被酒精破坏。H抗原共有64种。

3）K抗原

是细胞外部的荚膜或的表面物质，又称包膜抗原。新分离的大肠埃希氏菌70％具有K抗原。根据K抗原耐热的敏感性．可把K抗原分为A、B、L三类，共有103种，致病性大肠埃希氏菌的抗原主要为B抗原，少数为L抗原，B抗原与L抗原均可在煮沸后被破坏，A抗原耐热性强，可耐受煮沸1小时而不被破坏。，

O抗原可将大肠埃希氏菌分成若干血清群，再根据K抗原和H抗原进一步分为若干个血清型或亚型，根据大肠埃希氏菌抗原的鉴定结果，写出其抗原式如O111：K58(B)H12，一般认为H抗原与致病性无关，因此，一般不需要进行H抗原的鉴定。

5、抵抗力

抵抗力中等，各菌型之间存在差异。此菌对青霉素有中等抵抗力，对一般消毒剂都比较敏感。对氯尤为敏感，水中游离氯达到0．2mg／L时，即可杀死此菌。此菌在土壤中、水中及粪便中可存活数月以上。

6、毒素特性

有些大肠埃希氏菌产生肠毒素，

1）不耐热(LT)肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT）：化学成分为蛋白质，分子量较大，60℃ 30分破坏，具有免疫原性，可引起肠道分泌增加，出现腹泻。

2）耐热肠毒素（heat-stable enterotoxin，ST）：分子量较小，无抗原性，100℃ 30分钟，仍有活性，可引起肠分泌增加。

二、致病性

致病性大肠埃希氏菌属引起酌食物中毒主要有两种类型，一种是肠道内感染，另一种是肠道外感染，两者具有不同的机理和症状：

1、肠道内感染

1）肠毒素型大肠杆菌（ETEC）：主要引起腹泻（幼畜或雏鸡），约有40个血清型。肠毒素型菌株进入肠道后主要在小肠内繁殖，不损害肠上皮细胞。繁殖过程中产生肠毒素。

2）肠致病型大肠杆菌（EPEC）：是引起婴儿腹泻的主要病原菌，该菌不产肠毒素，也无侵袭力，致病机理不清，约有18个血清型。

3）肠侵袭型大肠杆菌（EIEC）：较少见，该菌不产肠毒素，但侵袭大肠肠壁上皮细胞，引起炎症反应，形成溃疡，约有8个血清型。引起类似痢疾的症状。

2、肠道外感染

三、主要症状

肠道内感染主要造成腹泻与痢疾样疾病；肠道外感染主要引起尿路感染，新生儿脑膜炎、败血症及其他部位的感染。

致病菌引起的食物中毒是感染型和毒素型的综合作用，致病性大肠杆菌引起的食物中毒主要症状为急性肠胃炎，潜伏期为12～24小时，临床出现呕吐、腹泻、发热(体温一般不超过39℃)、头痛、腹痛等，病程一般为1—3天。

四、流行病学特点

1、发病季节多发生在夏秋季

2、引起中毒的食品种类

与沙门氏菌相同。

3、食品种大肠埃希氏菌的来源

由于大肠杆菌存在于人和动物的肠道中，健康人肠道致病性大肠埃希氏菌率为2—8％，高者达44％，而成人患肠炎、婴儿患腹泻时，致病性大肠埃希氏菌率较健康人高，达29—52％。大肠杆菌随粪便排出而污染水源和土壤，进而直接或间接污染食物。

五、检验方法

致病性大肠埃希氏菌的检验应按《中华人民共和国国家标准——食品卫生检验方法(微生物学部分)》(GB489．6-84)的有关内容进行检验。

（一）增菌培养

1、以无菌操作的方法称取样品25g，加入225ml营养肉汤培养基中，可用灭菌砂在研钵中磨碎或以均质器打碎样品。

2、取适量接种于乳糖胆盐培养基中，测定大肠菌群MPN，其余移入500ml三角瓶中于36±1℃培养6小时。挑取一环，接种于一管30ml肠道菌增菌汤中，42℃增菌培养18小时。

（二）分离培养

1、将乳糖胆盐发酵阳性管液与增菌液分别划线接种于麦康凯或伊红美兰琼脂平板上。

2、于36±1℃培养18—24小时观察菌落

对于污染严重的食品可直接按划线法接种，不经过增菌过程。

（三）生化试验

1、初筛试验

选取在麦康凯或伊红美兰平板上发酵乳糖或不发酵乳糖的菌落5个以上，分别接种于克氏双糖铁、pH7.2尿素和阿拉伯糖中．经36C培养18～24小时，弃去H2S阳性或尿素酶阳性或阿拉伯糖阴性的培养物。

2、复筛试验

把筛留下的培养物分别接种于缓冲葡萄糖蛋白胨和KCN培养基中，经36+1℃培养48小时，观察生长结果并做V-P试验，弃去V-P阳性及KCN阳性的培养物。

3、证实试验

致病性大肠埃希氏菌属除氧化酶阴性，革兰氏阴性的特征以外，还有以下特性：葡萄糖产酸+，葡萄糖产气+／一，乳糖产酸+90％，柠檬酸盐—，尿素酶一，KCN-，V-P-，动力+或—，阿拉伯糖十，靛基质十95％：可按这些主化特性进一步证实其是否为致病性大肠埃希氏菌属。

（四）血清学试验

1、致病性大肠埃希氏菌血清学试验

假定试验：

从平板上选菌落生长稠密处挑取培养物，用致病性大肠埃希氏菌三种OK多价血清做玻片凝集试验。不凝集的培养物可做阴性报告。

证实试验：

2、侵袭性大肠埃希氏菌血清学试验

在平板上菌落生长稠密处挑取培养物，用侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清做玻片凝集试验，侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清包括两种：OK多价血清和9种OK单价血清：

（五）产肠毒素大肠埃希氏菌毒素试验

1、动物试验

将经过生化证实试验的大肠埃希氏菌培养物接种肉汤管，于36+1℃培养24小时，3000转／分离心30分钟。取上清液用G6滤器过滤后分作两份，一份加热60℃30分钟，供ST测定用，另一份不加热，供LT测定用。

1）家免结轧回肠段试验：

取体重为2kg的家兔，禁食使肠内容物排空。麻醉后剖腹，取出回肠段，按10～15cm为一段，分段结扎，取一段注射肉汤2mL作为阴性对照，另一段注射已知产毒菌肉汤培养物的上清液2ml作为阳性对照。其他各段分别注射待试菌株肉汤培养物的滤液2mL。将腹壁缝合。

测定LT时，于注射后18小时剖腹检查

测定ST时，于注射后6—8小时剖腹检查

取出肠管分别抽取肠段的积液，测定其容量，并测定肠段的长度。积液量(mL)与肠段长度(cm)之比大于l者为阳性。

2）乳鼠灌胃试验：

2、双向琼脂扩散试验

将被检菌按5点环形接种于Elek氏培养基上，以同样操作共做两份，36±1℃培养48小时，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素纸片，36+1℃经5—6时，使抗生素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的，挖一个直径4mm的园并用一滴琼脂垫底。在一份平板的孔内滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔内滴加ST毒素30ul。放于36+1℃经15～20小时观察结果，在菌斑和抗毒素之间出现白色沉淀带为阳性，无沉淀带者为阴性。

（六）豚鼠角膜试验

供测定侵袭性大肠埃希氏菌用，将经过生化证实试验的待试菌株18—20小时琼脂培养物，用肉汤洗下，使成每lml含菌9亿个菌悬液，作为接种材料。

体重400--500g的健康豚鼠(角膜与结膜外观正常，并经细菌培养检查)的角膜上接种待试菌悬液1滴。

48小时后观察结果，结膜充血浮肿、角膜混浊、眼内充盈泪液或浆液性分物者为阳性，自结膜囊取样分离细菌，鉴定应与原接种菌一致。

（七）结果报告

根据以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验和豚鼠角膜试验的结果出报告，如果是产毒大肠埃希氏菌时应有肠毒素试验的结果；如果是侵袭性大肠埃希氏荫应有豚鼠角膜试验和血清学试验的结果；如果是肠致病性大肠埃希氏菌时应有血清学试验结果。

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