探究环状RNA在疾病治疗中的应用前景

环状(circRNA)是一类特殊的共价闭环RNA分子，在调控生理和病理进程中，通过不同的机理发挥着重要作用。传统上，circRNA被认为是一种非编码RNA(ncRNA)。2014年，在北卡罗来纳大学报导了环形RNA在细胞内可通过非帽依赖的机理来翻译蛋白，人们认识到circRNA也具有编码与表达蛋白的能力。此后，随着体外环化技术的发展，比线性mRNA稳定性更强的合成circRNA成为mRNA治疗领域备受关注的新技术，有望以mRNA药物相似的递送方法，实现疾病的治疗。

图1 环状RNA结构

一、circRNA的特点

1、强稳定性：与线性RNA相比，circRNA的主要优势就是其环状结构提高了稳定性。因为circRNA中5’和3’末端的缺失使其具有外切酶抗性，不能通过典型的RNA降解途径降解，需要通过核酸内切酶线性化后将其降解（图2，a-c），因此，具有更高的体内稳定性，半衰期更长。

图2 circRNA的降解和翻译

2、非帽依赖性翻译：大多数真核生物mRNA的翻译起始于5’端，以典型的帽(7GpppN)依赖方式进行（图2，d），由于步骤复杂且需要招募较多起始因子，该过程具有高能量消耗的特点，因此，当机体处于病毒感染或疾病等细胞应激的不利条件下，该典型翻译起始将被整体抑制，以确保细胞响应应激并存活。那么当典型翻译机制下调时，维持细胞生存所需要的关键蛋白的产生就需要另一套非典型翻译机制，即非帽依赖性翻译—通过内部核糖体进入位点(IRES)来驱动，而这种非帽机制正适合无5’端的circRNA，已知IRES是circRNA主要的翻译方式。换言之，在疾病治疗过程中，当机体处于ER应激、遗传毒性应激、缺氧、营养剥夺、体温过低、体温过高或感染状态下，帽依赖性翻译起始被抑制，线性mRNA无法有效翻译，基于mRNA的药物疗效降低，而circRNA可凭借非帽依赖性翻译的机制优势，保证蛋白质的正常翻译，保证药物疗效。

3、多顺反子表达：多顺反子表达是指从单个mRNA分子中翻译两个或多个独立的基因。对于多顺反子线性mRNA，5’cap比IRES的表达更高，导致蛋白表达比例不均。而对于circRNA，通过引入多个IRES-ORF，有可能达到接近化学计量的多顺反子表达，因为所有编码的蛋白质都具有相同的翻译起始机制。虽然这一点尚未得到证实，但circRNA的多顺反子表达可能有益于多组分蛋白质疗法，其中蛋白质复合物组分的受控比例至关重要。

4、免疫原性低：线性RNA通过病原体识别受体（如RIG-I、TLR3、TLR7、TLR8等）刺激先天免疫，导致干扰素反应，进而对其翻译及应用造成了负面影响；而纯的circRNA并不存在RIG-I、TLR3、 TLR7及TLR8的识别序列，这种“免疫沉默(immunosilent)”可以使其更有效地表达蛋白质，而没有抑制性干扰素反应。此外，先天免疫系统激活减少限制了树突状细胞的活化和成熟，有助于防止对编码的治疗蛋白产生免疫力。

二、circRNA的应用

1、蛋白质替代疗法

蛋白质替代疗法的目的是恢复那些缺失或有缺陷的蛋白质功能，通常是由基因突变导致。采用mRNA治疗内源蛋白缺失已应用于多种疾病

相对于mRNA，circRNA在蛋白替代疗法的应用中具有诸多优势，如结构具有更高的稳定性，蛋白质表达时间更长；具有与线性RNA相似的蛋白表达峰值，但下降率较低。这些优势使得circRNA可以产生较高的蛋白质累积并持续较长时间；减少给药频率，且免疫原性较低。

2、疫苗

mRNA疫苗具有高效、研发周期短、模块化生产、低成本等优势，已是通用的疫苗种类，尤其在应对新冠等突发流行病，其极快的研发制造能力，优势极为显著。同时，在面对病毒变异方面，多价mRNA疫苗的易得性可及时提供针对多种病原体的保护，意义重大。

另外，mRNA疫苗的自佐剂效应也为疫苗保护性免疫的诱导提供了支持。在机制上，mRNA会引起与病毒免疫相关的Th1偏向免疫应答，诱导对T细胞扩增和免疫记忆形成至关重要的I型干扰素反应，对病毒预防极有帮助。不过该机制同时也限制了mRNA的帽依赖性翻译起始，影响表达效率。那么circRNA所使用的非帽依赖性起始机制，例如不受干扰素抑制的IRES，是一种有吸引力的替代方案。在保持circRNA抗原表达稳定的同时，更有效地诱导干扰素反应，可能会进一步增强疫苗的保护作用。

疫苗接种的目标是诱导强烈的适应性免疫反应和长期免疫记忆。适应性免疫记忆的诱导部分取决于抗原暴露的持续时间。因此，RNA编码抗原的长期表达可以更有效地引发具有持久免疫记忆的免疫反应 。与mRNA相比，circRNA固有的稳定性延长了蛋白质翻译的时间，增加了体内的蛋白质产量，长期表达抗原可以更有效地诱导具有持久免疫记忆的免疫反应。

3、癌症免疫疗法

癌症免疫治疗采用机体免疫的作用成分如细胞因子、抗体和免疫细胞等进行癌症的治疗。基于RNA的免疫治疗可以通过将癌症新抗原编码为疫苗、免疫刺激细胞因子、抗体和免疫细胞受体实现，具有灵活性及多功能性。此外，还可以通过非病毒载体以mRNA直接转染T细胞，在体原位生产CAR-T细胞，避免了传统CAR-T细胞制造的缺点。

circRNA在癌症免疫治疗中有几个优势：

1）与mRNA相同，circRNA既可应用于肿瘤个性化治疗，也可同时编码多种新抗原，降低癌症逃逸和复发风险。对于精准细胞治疗，可以通过改变编码序列轻松定制嵌合抗原受体的circRNA编码，并定制以靶向不同类型的癌症进行精准癌症免疫治疗；

2）circRNA的稳定性强，可以保证抗原蛋白的稳定表达；circRNA癌症疫苗可以延长抗原呈递，获得更强的免疫反应；增加免疫刺激蛋白，如细胞因子和小抗体片段的表达时间，可以更好地将免疫细胞招募到肿瘤部位；

3）早期研究表明，修饰mRNA的低免疫原性对肿瘤中的蛋白质表达很重要，因此circRNA固有的较低免疫原性对于肿瘤内免疫刺激蛋白表达更具优势。未修饰的RNA激活先天免疫系统将降低抗体表达，阻止适应性免疫细胞有效募集到肿瘤中；

4）由于IRES启动的非帽依赖性翻译既可适应各种复杂的肿瘤环境，也可抵抗癌细胞减缓蛋白翻译并逃逸细胞因子或抗体免疫治疗机制，增加了不同癌症治疗的一致性。

4、基因编辑

在基因编辑方面，基于circRNA的稳定性，首先可应用于小的RNA组分，比如向导RNA(adRNA/gRNA)，因为在基因编辑系统中的向导RNA是最脆弱的，很容易被核酸酶降解；其次，circRNA也有望用于编码基于蛋白质的编辑器以进行基因编辑。与mRNA相比，circRNA提供的稳定性和稳健表达可以使Cas9蛋白的持久性更长，增加的蛋白表达可能会显著提高基因编辑效率。

在ADARs介导的RNA编辑中，2019年，北京大学魏文胜课题组曾研发出了借助gRNA募集ADAR实现RNA精准编辑的新策略^[1]：LEAPER™。LEAPER™通过在细胞中表达短工程化的ADAR募集RNA(ADAR-recruiting RNA，arRNA)来完成ADAR的招募以及RNA编辑，由于这种技术彼时尚不成熟，具有一定长度的arRNA可能引起邻近的碱基的脱靶编辑。2022年，魏文胜课题组推出了LEAPER™的升级版本—— LEAPER™ 2.0，设计并运用了可招募ADAR的环形RNA(circular ARAR-recruiting RNA，circ-arRNA)^[2]，通过AAV递送，遗传编码的circ-arRNA可以在人的原代细胞和类器官中实现长时程的RNA编辑，这种可避免核酸外切酶切割的环状RNA进一步提升了体外和体内编辑的效率和精准性，基本清除了双链RNA区域内目标转录本上的脱靶。

5、非编码环状RNA治疗

circRNA在细胞内具有内源性非编码功能，如miRNA和RNA结合蛋白海绵功能。circRNA作为调控RNA，具有作为miRNA和RNA结合蛋白的竞争性抑制剂从而进行治疗的潜力。不过目前已有研究都处于体外实验阶段，尚未有体内数据，不过受限于递送问题，体内模型可能也难以实现。

circRNA是共价封闭的、高度稳定的RNA形式，具有巨大的治疗应用潜力。与线性蛋白相比，circRNA具有稳定性和蛋白质表达增强的能力等优点，在疫苗开发、癌症免疫治疗、蛋白质替代治疗和基因编辑方面有着广阔的可应用空间。总之circRNA在基于RNA的药物领域是一种有潜力的RNA形式，有望更新个性化治疗手段。

[1]Yi, Z., Zhu, S., et al. (2019). Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nature biotechnology, 37(9), 1059–1069. 

[2] Yi, Z., Qu, L., Tang, H. et al. Engineered circular ADAR-recruiting RNAs increase the efficiency and fidelity of RNA editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol 40, 946–955 (2022). 

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