用于ELISA实验的样本有多种类型,包括血清、血浆、细胞培养上清、尿液以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法存在差异。合适的样本预处理,是确保ELISA实验准确性的第一步。下面让我们一起来看看ELISA实验三类样本的处理方法吧!
一、液体样本
1. 血清
血清是ELISA实验常用的样本,其预处理也十分简单。使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本,将试管或离心管在室内温度下放置自然凝固(视室温环境10分钟到2小时不等)或4℃过夜,分离出血清,(建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面,使血清能更大程度的分离出来,),2-8℃条件离心5分钟左右(5000-6000转/分钟),仔细收集上清,立即进行测定,建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存,避免反复冻融,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
2. 血浆
应根据标本的要求选择EDTA、肝素钠、枸橼酸纳或柠檬酸钠作为抗凝剂,使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本,采集后30分钟内,混合10-20分钟后,2-8℃条件离心5分钟左右(5000-6000转/分钟),仔细收集上清液(血浆),建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存,避免反复冻融。样本应避免溶血或高血脂。保存过程中如有沉淀形成,使用前应该再次离心。
二、固体样本
1. 组织标本
切割标本后,称取1g组织,加入9ml的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或匀浆器将标本匀浆充分。2-8℃条件离心5分钟左右(5000-6000转/分钟),仔细收集上清。分装一份待检测,其余冷冻备用,保存过程中如有沉淀形成,使用前应再次离心。对于植物组织,不好匀浆的话,就在液氮中充分研磨。
2. 细胞内蛋白样本
许多待测蛋白不是分泌蛋白,而是存在于细胞内的蛋白,这个时候,要先收集细胞,洗涤干净,再破碎细胞,离心取上清。
三、植物样本
1. 标本的精采集及保存
取0.1g(误差±3%以内)新鲜植物组织样本,在液氮中充分研磨;加入1ml的提取液(80%甲醇), 置于-20℃过夜;于4℃,8000rpm,离心1小时,取上清。
上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是:80%甲醇(1ml)平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇(5ml)洗柱→100%(5ml)洗柱→100%甲醇(5ml)洗柱→循环。过柱后的样本真空干燥或氮气吹干,保存备用。
上样前加入pH7.4 PBS缓冲液(1ml定容)。混匀后室温放置30分钟,然后4℃离心(8000rpm,15分钟),取上清并暂时保存于4℃待用。
2. 植物标本中相关酶或蛋白的测定(粗提取)
新鲜植物组织请在液氮中充分研磨;加入样品体积9倍的提取液(pH 7.4 PBS缓冲液),请于4℃,8000rpm,离心30分钟,取上清并暂时保存于4℃待用。
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