T4 DNA连接酶（T4 DNA Ligase）是一种由T4噬菌体编码的酶，以ATP作为辅因子，催化双链DNA或RNA的5’-磷酸与3’-羟基之间形成磷酸二酯键。该酶既能催化黏性末端分子间或平末端分子间的连接，也能修复双链DNA或DNA-RNA杂交双链上的单链DNA切口，广泛用于NGS测序，分子克隆等应用。然而，T4 DNA连接酶在实际应用中仍存在一些挑战，包括稳定性差、接头自连率高或DNA建库产量低等问题。这些问题可能导致实验效率的降低、数据质量的下降、实验结果的重复性差以及产物纯度低等，进而影响分子生物学实验的整体效果和测序数据的准确性。为了解决这些问题，翌圣镁孚泰生物基于ZymeEditorTM创新型酶进化平台对T4 DNA连接酶进行了酶改造。
图1.T4 DNA 连接酶反应原理
干湿实验交互筛选
获得高性能T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶的结构由紧密缠绕的DNA结合域（DBD）、核苷酸转移酶（NTase）域以及OB折叠域构成。通过蛋白质结构分析，对DNA底物周围5至20埃范围内的氨基酸残基进行了模拟筛选和结构-功能分析。分析结果揭示了T4 DNA连接酶中存在一个远离活性中心的柔性环。接着，基于能量计算，设计了对这个环区域的截断。同时，通过对齐共识序列，并结合结构与功能数据的综合分析，精心设计突变体。
图2.T4 DNA 连接酶
除了采用理性设计方法外，还通过微孔板筛选技术（MTPs）对T4 DNA连接酶进行了定向进化。筛选了超过10^4个突变体的库后，成功获得了具有更高稳定性和更高活性的T4 DNA连接酶突变体。通过对大量突变体的数据分析，从中挑选出有潜力的候选突变体进行纯化，并准备进行后续测试。所有通过理性设计和定向进化获得的突变体，在经过精细纯化后，都进行了详尽的表征分析。这包括对其活性、稳定性、接头自连接、DNA片段自连接以及DNA产量的评估，旨在开发出能够满足多样化应用需求的高性能突变体。
数据展示
更高的热稳定性
热稳定性分析：翌圣镁孚泰生物≈供应商N≈供应商A >供应商T >供应商Q。
建库产量分析：翌圣镁孚泰生物≈供应商Q≈供应商T >供应商A >供应商N。
图3.42℃热稳定性测试（Molefuture表示翌圣镁孚泰的T4 DNA连接酶突变体，下同）
更高的建库产量
1 µg gDNA投入量下的建库产量分析：翌圣镁孚泰生物>供应商Q≈供应商T≈供应商A >供应商N。
0.5 µg gDNA投入量下的建库产量分析：翌圣镁孚泰生物≈供应商Q≈供应商A≈供应商T >供应商N。
图4.DNA建库产量分析
更低的接头自连
0 ng gDNA投入量下的接头自连分析：供应商N > 翌圣镁孚泰生物 > 供应商T > 供应商A > 供应商Q。
0.5 ng gDNA投入量下的接头自连分析：翌圣镁孚泰生物 > 供应商T > 供应商Q ≈ 供应商N > 供应商A。
图5.投入0、0.5 ng gDNA的接头自连数据
T4 DNA ligase突变体订购指南
