Deletion of BACH1 Attenuates Atherosclerosis by Reducing Endothelial Inflammation
Keywords: BACH1; YAP; atherosclerosis; endothelial inflammation; hemodynamics.
动脉粥样硬化是冠状动脉疾病（CAD）的主要原因。内皮功能障碍和血管炎症在动脉粥样硬化的发生和发展中起着关键作用。
全基因组关联研究（GWAS）已发现与CAD 发病相关的多个基因多态性位点，转录因子BACH1（BTB-CNC 同源体1）的表达与冠心病风险位点rs2832227单核苷酸多态性密切相关，先前被确定为 CAD 的风险位点。以往研究表明，BACH1 增加内皮细胞（EC）凋亡，减少 EC 增殖和迁移，并抑制缺血和发育性血管生成。据报道，Bach1 的整体敲除可上调载脂蛋白E-缺陷小鼠的血红素加氧酶-1（HO-1）表达并减轻动脉粥样硬化。然而，BACH1 如何导致动脉粥样硬化的潜在机制仍不清楚。
动脉分支和主动脉弓（AA）的血流模式受到干扰，内皮细胞中受扰动流影响的相关基因的表达促进动脉粥样硬化的形成。YAP 是一种转录辅助激活因子，是由血管炎性细胞因子或振荡剪切应力（OSS）诱导的白细胞-EC 粘附的关键介质，对血管炎性反应和动脉粥样硬化至关重要。
基于此，复旦大学基础医学院孟丹教授团队与复旦大学附属浦东医院余波教授团队合作在Circulation Research期刊发表了题为“Deletion of BACH1 Attenuates Atherosclerosis by Reducing Endothelial Inflammation”的研究成果。该研究旨在检测内皮细胞 BACH1 在动脉粥样硬化发病机制中的作用，利用生成的EC 特异性 Bach1 敲除小鼠，观察到 Bach1 的缺失抑制了小鼠血管炎症并减轻了湍流或西方饮食诱导的动脉粥样硬化。基于研究结论，将 BACH1 确定为内皮炎症和动脉粥样硬化的一种新型调节因子。
首先，为了支持 BACH1 在动脉粥样硬化中的潜在重要作用，研究人员分别证明了从有脑血管症状（短暂性脑缺血发作、一过性黑朦或中风）的患者中获得的颈动脉斑块中 BACH1 转录物的上调以及在ApoeKO高脂血症小鼠的动脉粥样硬化 AA 内皮中也观察到 BACH1 表达的增加。这些结果提示，内皮细胞 BACH1 可能参与动脉粥样硬化的发展。
为了研究不同的血流模式是否在体外调节 BACH1 表达中发挥作用，测量了受振荡流（OSS，± 4 dynes/cm2，1Hz，6/24h）的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中的 BACH1 蛋白水平。结果发现，与层流剪切应力相比，暴露于 OSS 的 HUVECs 中 BACH1 表达和核定位增加。然后，研究了 BACH1 是否介导了OSS 下 ECs 的促炎反应，发现OSS 上调了粘附分子 （ICAM1、VCAM1）的水平，而 BACH1 的敲低减弱了这种反应。
同时，构建了内皮特异性 Bach1 ECKO缺失小鼠，在高胆固醇饮食 4 周后通过部分结扎左颈动脉在体内探索OSS 相关的动脉粥样硬化是否由内皮 BACH1 介导，正如预期，发现与对照组相比，Bach1 ECKO小鼠在4 周后斑块形成减少。这些结果确定了BACH1 是血流紊乱相关动脉粥样硬化的潜在介质。
为了探讨BACH1 在高胆固醇血症小鼠动脉粥样硬化病变形成中的作用，用AAV8-PCSK9D377Y 感染Bach1 ECKO小鼠和Bach1 WT对照小鼠。与 WT 对照相比，Bach1 ECKO降低了雄性和雌性小鼠主动脉中的油红 O 染色（图1 A、B），两者均表现出位于 AA 和胸主动脉（TA）处的病变减少（图1 C）。组织学分析表明，Bach1 ECKO减小了动脉粥样硬化斑块的大小（图1 D），且主动脉根部切片病变内 Mac3+ - 巨噬细胞的数量减少（图1 E）。经过 12 周的高胆固醇饮食，Bach1 ECKO小鼠血浆 TNF-α 和 IL-1β 水平显著降低（图1 F）。这些数据表明，Bach1 的缺失减轻了雄性和雌性小鼠的动脉粥样硬化病变。
图1 内皮细胞特异性缺失Bach1改善西方饮食诱导的动脉粥样硬化。
单核细胞对ECs 的粘附是动脉粥样硬化的初始步骤。因此，接下来研究了 EC-BACH1 在单核细胞粘附中的作用。值得注意的是，在小鼠和人类细胞中均观察到EC-Bach1 的缺失降低了单核细胞-内皮细胞的粘附，而BACH1 的过表达增强了双方的粘附作用。
进一步地，在 ECs 中进行了 BACH1 功能丧失或功能获得，并检测了粘附分子、促炎细胞因子和趋化因子的表达。结果发现，敲低 BACH1 降低了 TNF-α诱导的粘附分子（ICAM1 和 VCAM1）和趋化因子（MCP1和 CCL5）在 HUVCEs 中的表达。与体外发现一致，与 WT 小鼠相比，Bach1 ECKO 小鼠的动脉粥样硬化病变和ECs中 ICAM1 和 VCAM1 表达显著降低。内皮 Bach1 的缺失也减弱了 TNF-α诱导的Bach1 ECKO小鼠内皮细胞中粘附分子和趋化因子（Mcp1和Ccl5）的mRNA表达。这些结果表明，BACH1 通过促进单核细胞-内皮粘附以及粘附分子和促炎细胞因子的表达参与动脉粥样硬化的启动。
为了探索 BACH1 是否与 YAP 相互作用，进行了免疫共沉淀测定，进一步证实了生理条件下BACH1 与 YAP 在细胞核和细胞质中的共定位。此外，观察到 TNF-α 以时间依赖性方式增加 ECs 中 BACH1 和 YAP 的蛋白水平，促进了两者之间的相互作用，并增加其在 ECs 中的核定位。当 HUVECs 暴露于 OSS 时，也观察到 ECs 中 BACH1 和 YAP 的核定位增加。ChIP-qPCR 检测证实了 BACH1 和 YAP 均与 ICAM1 和 VCAM1 的启动子结合。TNF-α 刺激增强了 BACH1 和 YAP 对这些基因启动子的富集。这些数据表明，BACH1 是 YAP 的转录相互作用伴侣，TNF-α 促进 BACH1 和 YAP 的核积累，增加它们对粘附分子启动子的募集，进而驱动粘附分子在 ECs 中的转录。
在 YAP 基因启动子区域鉴定出 BACH1 结合位点（图2 A），因此研究假设 BACH1 可能与 YAP 的启动子区域结合并调节 YAP 表达，观察到 ECs 中BACH1 过表达显著增加YAP 表达，而 BACH1 敲低减少YAP 表达（图2 B）。此外，BACH1 过表达增强，其敲低降低 YAP mRNA 水平和启动子活性（图2 C）。ChIP-qPCR 检测证实了 BACH1 与 ECs 中的 YAP 启动子结合（图2 D）。BACH1 过表达增加了 YAP 荧光素酶报告基因构建体的活性，但不影响含有BACH1结合位点突变的YAP荧光素酶报告基因（图2 E）。这些数据表明，BACH1 与 YAP 启动子结合并激活其转录。
然后，研究又探讨了 TNF-α诱导的 YAP 核积累是否依赖于 BACH1。正如预期，敲低 BACH1 降低了 TNF-α诱导的 YAP 蛋白表达（图2 F），降低了 YAP 核定位（图2 G），并在 TNF-α刺激后减少了 YAP 对 ICAM1 和 VCAM1 基因的富集（图2 H）。与体外结果一致，与WT小鼠相比，Bach1 ECKO小鼠动脉粥样硬化病变中内皮细胞YAP的表达降低（图2 I）。
图2 BACH1 结合到YAP启动子上激活其转录。
最后，研究探讨了YAP 过表达是否可以在体内消除 Bach1 缺失介导的抗动脉粥样硬化作用。实验观察到，Bach1 ECKO 小鼠的动脉粥样硬化病变面积、ICAM1和斑块内膜巨噬细胞浸润（图3 A-C）以及血浆IL-1β水平（图3 D）均显著降低，而YAP过表达的Bach1 ECKO小鼠则没有显著降低。这表明，EC 特异性 YAP 过表达在体内抵消了 Bach1 缺失介导的抗动脉粥样硬化作用。
此外，与健康主动脉相比，BACH1 和 YAP 在有动脉粥样硬化斑块的人主动脉内膜中高表达（图3 E），且观察到共定位（图3 E）。同时，BACH1 的 mRNA 表达与人颈动脉斑块中的 YAP、ICAM1、IL-1β、VCAM1 和 CCL5 呈正相关（图3 F）。
进一步地，为了探究现有的抗动脉粥样硬化药物是否抑制 BACH1 表达，研究人员还测试了几种药物，发现他汀类药物降低了 BACH1 mRNA 水平，尤其是瑞舒伐他汀（Rosuvastatin）。瑞舒伐他汀在 TNF-α刺激后显著降低 BACH1 和 YAP 表达，并减弱 TNF-α诱导的 ICAM1 和 VCAM1 表达。但是，瑞舒伐他汀未能抑制 BACH1 诱导的粘附分子和趋化因子的表达，在 TNF-α刺激下，BACH1 敲低的 HUVECs中粘附分子和趋化因子的减少也不受瑞舒伐他汀的显著影响。
为了进一步测试瑞舒伐他汀是否影响体内动脉粥样硬化易感内皮中 BACH1 的表达，用 AAV8-PCSK9D377Y 感染 WT 雄性小鼠，喂食8 周西方饮食，然后胃内给药瑞舒伐他汀持续2 周。与体外研究结果一致，瑞舒伐他汀显著降低动脉粥样硬化敏感的 AA 内皮细胞中 BACH1 和 YAP 的表达，还减弱了 ICAM1、IL-1β 和 CCL5 的表达。这些数据表明，瑞舒伐他汀抑制BACH1 可能参与了抗炎和抗动脉粥样硬化作用。
图3 内皮细胞特异性YAP 过表达可抵消BACH1 缺失介导的体内抗动脉硬化作用。
图4 图形概要
BACH1 是内皮细胞炎症和动脉粥样硬化的关键介质。在血流受干扰或 TNF-α刺激后，BACH1 和 YAP 被诱导并易位到 ECs 的细胞核中。BACH1 通过与 YAP 启动子结合来上调 YAP 表达，BACH1 与 YAP 形成复合物，诱导促炎基因的转录。瑞舒伐他汀通过降低 BACH1 的表达减轻内皮炎症和动脉粥样硬化。
综上所述，该研究结果表明，BACH1 作为新的血流动力学机械传感器，激活内皮细胞，并促进动脉粥样硬化。此外，BACH1-YAP 转录网络在促进内皮炎症和动脉粥样硬化生成方面至关重要。他汀类药物对 BACH1 的抑制作用使 BACH1 成为一种治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的新靶点。
参考文献：Jia M, Li Q, Guo J, Shi W, Zhu L, Huang Y, Li Y, Wang L, Ma S, Zhuang T, Wang X, Pan Q, Wei X, Qin Y, Li X, Jin J, Zhi X, Tang J, Jing Q, Li S, Jiang L, Qu L, Osto E, Zhang J, Wang X, Yu B, Meng D. Deletion of BACH1 Attenuates Atherosclerosis by Reducing Endothelial Inflammation. Circ Res. 2022 Apr;130(7):1038-1055. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.319540. Epub 2022 Feb 24. PMID: 35196865.
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