Disturbed flow impairs MerTK-mediated efferocytosis in aortic endothelial cells during atherosclerosis
Keywords: Disturbed flow; MerTK; RNA-seq; atherosclerosis; efferocytosis; proteomics.
动脉粥样硬化是缺血性心脏病和中风最常见的潜在原因。大量证据表明，动脉分支和弯曲处的扰动流（d-flow）模式更易导致动脉粥样硬化病变，而存在高剪切应力的稳定层流（s-flow）区域则可防止动脉粥样硬化。主动脉内皮细胞（ECs）是血管壁内层的主要成分，直接暴露在血流中，在各种化学和机械刺激下对血管功能发挥重要作用。
MER 原癌基因酪氨酸激酶（MerTK）是 TAM（Tyro3、Axl 和 MerTK）受体家族的成员，在多种恶性肿瘤中高度表达，其在有效清除凋亡细胞中起关键作用，这一过程称为胞葬作用（Efferocytosis）。晚期动脉粥样硬化中胞葬作用受损可导致继发性细胞坏死和坏死碎片积聚形成的坏死核心，从而引发斑块破裂和急性血栓性心血管事件。最近研究报道了原发性主动脉 ECs 具有很高的胞葬作用能力，且在血管衰老中起重要作用。
然而，以往的研究并未显示血流模式与 EC 胞葬作用之间的直接联系，以及血流模式与 MerTK 表达之间的相互作用。MerTK 在 d-flow 介导的内皮功能障碍中的作用及其对动脉粥样硬化病理过程的影响也是未知的。因此，美国佐治亚州立大学生物学系的课题组在最近的研究中旨在解决这些未知问题，并证明了血流模式在调节MerTK 介导的主动脉内皮细胞胞葬作用中发挥重要作用。研究成果发表在 Theranostics 期刊题为“Disturbed flow impairs MerTK-mediated efferocytosis in aortic endothelial cells during atherosclerosis”。
MerTK 主要在巨噬细胞中表达，关于MerTK 在 ECs 中表达的研究非常有限。因此，实验首先对健康个体及恶性白血病患者的不同类型造血细胞的表观遗传图谱进行了大数据分析，发现MerTK 在 CD14++CD16- 单核细胞、巨噬细胞和效应B 细胞以及内皮祖细胞和静脉 ECs 中高度表达（图1 A）。进一步大数据分析（图1 B）显示，MerTK 在血管（如主动脉、冠状动脉和胫动脉）、心脏（如左心耳和左心室）和血液（如转化的淋巴细胞和全血）中表达。
然后研究了凋亡细胞是否可以激活主动脉 ECs 中的 MerTK 表达和胞葬作用。Western blotting 显示，凋亡的 Jurkat 细胞在原代人主动脉 ECs（HAECs）中显著诱导 MerTK 表达（图1 C）。免疫染色显示，HAECs 具有很高的胞葬作用能力，可以清除凋亡的 Jurkat 细胞（图1 D）。有趣的是，凋亡的 Jurkat 细胞以时间和剂量依赖性方式诱导 MerTK 表达（图1 E、F），且MerTK 表达在细胞比例为 1：1 时表达最高。
为了阐明被吞噬的 Jurkat 细胞是否是 HAECs 中 MerTK 表达增加的原因，将非凋亡的 Jurkat 细胞和凋亡的 Jurkat 细胞与 HAEC 一起孵育（图1 G）。一方面，发现 MerTK 在 Jurkat 细胞中高表达；另一方面，发现凋亡的 Jurkat 细胞显著激活 HAECs 中的 MerTK 表达。这表明凋亡的 Jurkat 细胞可部分解释 EC MerTK 表达的增加。
为了研究 d-flow 在 HAECs 中 MerTK 表达中的作用，应用了低振荡剪切应力（OSS，± 5 dynes/cm2，1Hz，1 h）和d-flow（12 ± 4 dynes/cm2，1 h）。与静态组相比，OSS 显著抑制 HAECs 中的胞葬作用（图1 H）。p70 S6 激酶（p70S6K）的激活是病理生理条件下血管重塑的重要过程；真核起始因子2α（EIF2α） 参与内质网应激下血管内皮细胞的凋亡激活；真核起始因子3a（EIF3A）调节蛋白质合成，其水平在晚期动脉粥样硬化病变中升高。研究表明，与静态相比，OSS 显著诱导 p70S6K、EIF2α 和 EIF3A 的表达（图1 I-K）。此外，d-flow 显著抑制 MerTK 表达，同时诱导内皮功能障碍，表明促炎信号表达增加，如 NLRP3 炎性小体、TNF-α 和 NF-κB（图1 L）。一致地，OSS 显著抑制 MerTK 表达并诱导内皮功能障碍，表现为eNOS、Gas 6（MerTK 配体）和TGF-β表达的降低（图1 M）。
图1 ECs 中的胞葬作用和 d-flow 在 MerTK 调节中的作用。
为了进一步研究 d-flow 在调节内皮功能中的作用，将暴露于d-flow或静态条件下的HAECs 进行了RNA-seq，随后与凋亡的Jurkat细胞孵育。结果表明，d-flow 上调促炎细胞因子、细胞死亡通路和衰老通路，这些都会导致内皮功能障碍。此外，在 d-flow和动脉粥样硬化之间发现了几种新的激活途径，例如OMA1、SR 1078和 EIF2AK3 。还有几种新的抑制途径，例如 PPP1R15B、CX3CR1和 CITED2 。细胞因子和趋化因子分析显示，d-flow 显著抑制 CCL2、PF4和 IL-10的表达，同时诱导 IL-1β、CD40LG和 IFN-γ的表达。Z-score分析表明，d-flow 显著激活 NF-κB 复合物、TNF 和 TLR4 通路。内皮功能分析发现，d-flow 促进血管系统的发育、血管发生和血管生成，同时抑制心脏发育、EC 运动和 EC 迁移。
然后利用动脉粥样硬化模型（PCL）将 AAV8-PCSK9 与高脂肪饮食（HFD）相结合（图2 A），研究 MerTK 是否受体内血流模式的调节。Western blotting 数据显示，与s-flow（12 ± 4 dynes/cm2，24 h）的对照 RCA 相比，MerTK 在充满 d-flow 的 LCA 中受到显著抑制，表明 MerTK 对体内血流模式敏感（图2 B）。同样，MerTK 在胸主动脉直段（s-flow）中的表达远高于主动脉弓（d-flow，图2 C）。值得注意的是，在主动脉弓中，缺乏 MerTK 的内皮区域似乎在动脉介质巨噬细胞中表现出 MerTK 表达增加，这表明与血管功能障碍相关的凋亡细胞增加。图2 D 显示了 WT 小鼠 LCA 中凋亡标志物 caspase-3 的免疫染色和主动脉夹层的形成，表明 PCL 可能是主动脉瘤和夹层的潜在模型。此外，RCA 中没有斑块形成，而 WT 和 MerTK- /- 小鼠的 LCA 中发现明显的斑块形成，与 RCA 相比，裂解的 IL-1β和 caspase-3 在有斑块区域的 LCA 中均显著增加（图2 E）。
为探讨体内是否存在内皮胞葬作用，对主动脉弓中 MerTK 和 Caspase-3 进行双重免疫染色，发现 WT 小鼠中MerTK 主要在内皮中表达，并检测到内皮胞葬作用（图2 F）。还研究了 WT 和 MerTK-/- 小鼠主动脉弓中内皮功能障碍标志物的表达，数据显示，与 WT 小鼠相比，MerTK-/- 显著诱导 NF-kB、TLR4、vWF、VACAM-1 和 p22phox 的表达（图2 G-J）。这些发现表明MerTK 对体内 d-flow 敏感，可调节内皮胞葬作用和内皮功能障碍，提示MerTK在动脉粥样硬化发展过程中的内皮功能障碍中起关键作用。
图2 WT 和 MerTK- /- 小鼠的 PCL 手术和动脉粥样硬化模型。
最后，研究分析了 PCL 手术后 MerTK-/- 小鼠 RCA 和 LCA 的蛋白质组学，其中包括 172 种上调蛋白和 87 种下调蛋白，前几种蛋白变化包括 CD34、Col4a1和 Eln等。此外，发现丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）可能在 PCL 诱导的 d-flow 与血管功能之间的相互作用中发挥重要影响，MAPKs（如MAPK1、3 和 JNK）在接受急性 d-flow 的 LCA 中被激活。有趣的是，实验注意到有许多胶原蛋白信号参与来自激活和抑制因果网络中的 LCA蛋白质变化。与 RCA 相比，LCA 中诱导的胶原蛋白（如Col14a1、Pcolce、Col12a1、Col1a2/1、Plod2）显著更高。LCA 与 RCA 的重叠网络分析显示了激活的通路（如胶原蛋白、AKT 和 CD34）和抑制通路（如MYC-、免疫球蛋白和其他胶原蛋白亚基）。
此外，还比较了 PCL 手术后 WT 和 MerTK-/- 小鼠 LCA 中蛋白质组学的变化，发现了 52 种上调蛋白和 57 种下调蛋白。实验发现，与 WT LCA 相比，MerTK -/- LCA 中多种通路时被抑制时，如免疫细胞增殖、肌动蛋白细胞骨架信号和 EIF2 信号，ASXL1 被特异性激活。ASXL1 在动脉粥样硬化中的作用在很大程度上仍然未知，EIF2 下调促进动脉粥样硬化，表明 ASXL1 和 EIF2 可能在血流动力学介导的 EC 胞葬作用中发挥新作用，这需要进一步验证。基于 Log2 倍变化的排名靠前的激活信号和抑制信号包括 Podip3、Klk1b22、lghg等。
粘附分子、促炎因子或抗炎因子和趋化因子在动脉粥样硬化中起重要作用。因此，继续研究了蛋白质组学中 MerTK 在调节炎症因子和趋化因子中的作用。与上述发现一致，与 WT 组相比，MerTK-/- 激活炎症因子 MAP4K4，同时抑制抗炎因子（如IL-4、TGF-β 1 和 IL-10RA）和抗炎趋化因子CXCL12。与 WT LCA 相比，MerTK-/- LCA 中线粒体功能障碍激活、EIF2 信号、Eif3 和 P70s6K 信号和蛋白质泛素化通路抑制。进一步分析了激活信号网络（如JUN-jun 原癌基因、FOS-fos 原癌基因、AP-1 家族激活蛋白-1 和 HIF1α-缺氧诱导因子 1亚基α）和抑制信号网络（如IL-4、IL4 受体-IL4R 和 STAT3,4 信号转导和转录激活因子3,4）。并基于p 值总结了相关的疾病通路，表明 MerTK-/- 可能导致感染、脑功能障碍、心功能障碍、外周动脉疾病、硬化病变和动脉闭塞。
图3 图形概要
数据表明，原发性人主动脉内皮细胞（HAECs）中MerTK 对血流模式敏感，并受到扰动流和振荡剪切应力的抑制。与凋亡细胞一起孵育的 HAECs 中的 RNA-seq 数据显示，d-flow 促进促炎途径和衰老途径。蛋白质组学和免疫染色体内数据表明，与 WT 组相比，MerTK-/- 通过上调内皮功能障碍标志物（如IL-1β、NF-κB、TLR4、MAPK 信号、vWF、VCAM-1 和 p22phox）和线粒体功能障碍加重d-flow 区动脉粥样硬化。有趣的是，MerTK-/- 可诱导明显的异常内皮增厚，伴有内皮胞葬作用减少，促进动脉粥样硬化的发展。
总之，该研究为 d-flow、MerTK 和内皮胞葬作用之间的关系及其在动脉粥样硬化中的影响提供了证据。值得注意的是，主动脉内皮细胞具有很强的胞葬作用能力，在 HAECs中凋亡的Jurkat细胞可在1 小时内被高度吞噬。此外，由于HAECs 的细胞体积较大，其胞葬作用可能比巨噬细胞更高，这为内皮胞葬作用可能是治疗动脉粥样硬化的有前途的治疗靶点提供了重要的转化线索。
参考文献：Wu J, Liu S, Banerjee O, Shi H, Xue B, Ding Z. Disturbed flow impairs MerTK-mediated efferocytosis in aortic endothelial cells during atherosclerosis. Theranostics. 2024 Mar 31;14(6):2427-2441. doi: 10.7150/thno.93036. PMID: 38646649; PMCID: PMC11024847.
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