液相色谱法（液相色谱仪）检测火腿肠中苯甲酸和山梨酸

火腿肠是深受广大消费者欢迎的肉类食品,我国已出台并在2007年6月1日实施《火腿肠》国家标准（GB/T2012-2006），标准规定了根据原料不同又有“鸡肉肠”、“鱼肉肠”、“牛肉肠”等品种。为防止食品变质，生产厂家常在火腿肠中加入防腐剂。我国目前常用食品防腐剂主要有苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐为主。防腐剂可以抑制和杀灭微生物，但过量和超范围使用会破坏食品中维生素、加重人体肝脏负担并引起毒性反应。国标GB2760-1996《食品添加剂使用卫生标准》中规定火腿肠类肉制品食品中苯甲酸不得检出，山梨酸及其钾盐（以山梨酸计）不得超过0.075g/kg。在日常检测工作中仍可在火腿肠样品中检出苯甲酸和超标加入的山梨酸。

    火腿肠中苯甲酸和山梨酸的测定样品处理方法，在国标GB/T5009. 29 - 2003中苯甲酸、山梨酸测定的液相色谱法中，只规定了饮料和配制酒样品处理方法,其它样品处理没有提及。火腿肠食品中含高蛋白、高脂肪及淀粉等基质成份较多,并且苯甲酸、山梨酸具有脂溶性的性质决定了样品处理的复杂性。南京科捷针对火腿肠食品特点，对液相色谱法测定火腿肠中苯甲酸、山梨酸的样品处理方法进行了改进和研究，建立了有效的液相色谱法测定火腿肠食品中防腐剂含量的样品处理方法。

二、LC-10Tvp梯度液相色谱仪配置

LC-10Tvp高压恒流泵：2台

SPD-10Tvp紫外检测器：1台 
SCL-10Tvp 系统控制器：1台
7725i手动进样阀： 1套 
色谱工作站：1套    （VI2010、N2000、N3000选用）
液相色谱柱：1支     （C18 4.6*250mn,5um）
微量进样器：1支     （50ul/100ul）

   进样支架  ：1只     （进样阀用）
三、LC-10Tvp梯度液相色谱仪特点

LC-10Tvp梯度液相色谱仪是南京科捷分析仪器有限公司为了快速地满足多样化的客户需求，在原有的STI501液相色谱仪的基础上经过优化，利用美国*技术开发设计，国内加工生产的的一款新型的液相色谱仪。LC-10Tvp等度液相色谱仪实现了人机对话，可实时对仪器的运行状态进行监控，并可对潜在和已出现的故障做出判断，同时提供在线解决方案。该仪器也全面实现了远程的准无人操作，大大提高了仪器的使用效率，同时通过高精度的AS1000自动进样系统，实现自动化进样，zui大程度抑制了样品的交叉污染，提供样品分析精度。LC-10Tvp等度液相色谱仪可广泛应用于研究开发、医药检验、食品检测、化工分析、环境监测等众多分析领域。

主要特点
    丰富的功能——符合客户对分析的不同需求
    硬件具有VP功能，记录维护信息和操作记录，符合GLP/GMP要求；系统控制器增具有时钟、温度计、湿度计等人性化设计的功能。
    的性能——满足客户对仪器的严格要求
    检测器采用进口氘灯、光电池以及1200条/mm凹面光栅组成的双光束单色器；精密加工的双透镜流通池，控制波长调节的高精度微处理器以及双路高速的采样频率，确保了低噪声、低漂移及超高灵敏度等特点。
    VI2010工作站符合多种法规要求。

    可靠的结果——满足客户对结果的准确要求
    与进口仪器做对比试验,分析结果具有高度的一致性。

    简便的操作——便于客户对软件的熟练操作
    软件采用多窗口模式，操作方便。
    精美的外观——满足客户对仪器的视觉要求
    外形精美，带来视觉上的享受。
技术指标 

四、火腿肠中苯甲酸和山梨酸的测定的详细检测方法。

1.1 仪器与试剂

LC-10Tvp液相色谱仪

SPD-10Tvp紫外检测器

ODS  C18反相色谱柱

HY-4多用样品振荡器

0.45μm微孔滤膜

甲醇（色谱纯）

0.02mol/L乙酸铵溶液

20目海砂

10g/L氢氧化钠溶液,100g/L亚铁溶液；200g/L乙酸锌溶液；苯甲酸、山梨酸标准液

1.2 液相色谱条件

流动相:甲醇+乙酸铵溶液（0.02mol/L）=5+95

流速：1.0ml/min

柱温：室温

紫外检测波长：230nm

1.3 样品处理与测定

将火腿肠样品用组织捣碎机均质后，称取5.0g于具塞三角瓶中,加入2～5g 20目海砂，搅拌均匀，加入50.0ml水、1.0ml氢氧化钠溶液，盖塞放于样品振荡器上振荡提取1h，加入9.5ml亚铁溶液、9.5ml乙酸锌溶液,振摇使其充分混匀后,静置1～2h使其沉淀（也可用离心机以3000转/min,离心10min）。用滤纸初滤去除脂肪和沉淀物，收集初滤液用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液10μl进行HPLC测定。

2 结果

2. 1样品提取条件的选择

在碱性条件下，苯甲酸与山梨酸形成相应的盐类而易溶于水，故加入氢氧化钠溶液使之形成可溶于水的盐。用水提取样品中苯甲酸、山梨酸可选用超声波法、振荡法、直接浸泡法。火腿肠样品在用组织捣碎机均质后，非常黏稠并易结成块状，不能与提取液充分接触，而造成提取效率低。故在样品中加入海砂，以分散黏稠的样品,使与提取液充分接触。在样品加入提取液后分别用超声波提取30min、振荡提取1h、直接浸泡过夜（24h）然后过滤,取滤液进行HPLC测定，对这三种样品提取方法的结果进行了比较。从实验结果分析,直接浸泡和超声波提取方法结果回收率低,不能满足检测方法的要求,只有振荡法回收率达到方法要求。原因是振荡器提取是通过不断振荡，海砂不断冲击分散黏稠成块的样品，使样品与提取液充分接触混匀，从而提取*，结果回收率高,故选用振荡提取方式用于本方法的检测。

2. 2 蛋白质和淀粉对分析方法干扰与消除

火腿肠样品中含有丰富的蛋白质和部分淀粉,样品在浸泡提取过程中,会含有大量的水溶性蛋白质和淀粉，如果净化不*，直接过膜进行HPLC分析，将堵塞色谱柱,严重影响色谱柱的使用寿命。因此火腿肠样品处理的关键是找到一种理想的沉淀剂,尽量排除样品中的油脂、蛋白质、淀粉等,并且不影响待测组分的回收率。常用食品蛋白沉淀剂有100g/L硫酸铜溶液、100g/L钨酸钠溶液、100g/L亚铁与200g/L乙酸锌溶液。硫酸铜溶液对于蛋白质含量低的样品尚可,而对于火腿肠食品则不理想,经实验发现初滤液混浊不能通过滤膜。钨酸钠溶液沉淀效果好些,经实验发现初滤液仍有堵塞滤膜的现象。亚铁和乙酸锌溶液作为沉淀剂通过实验发现效果,不仅可沉淀蛋白质,还可使淀粉变性沉淀,基本可使提取液澄清,初滤液可顺利通过滤膜,故选用亚铁与乙酸锌作为沉淀剂。

2. 3 脂肪对分析方法的干扰与消除

提取液所含的脂肪在振荡时可成球状悬浮在上层,并且在加入蛋白沉淀剂后,还可减少脂肪的乳化作用使脂肪与提取液充分分离。对于脂肪含量很高的样品,可将样品提取液置于沸水浴中15min使脂肪充分熔化,取出冷至室温后,放于. 1℃冰箱中进行冷冻处理,大多数脂肪在冰点处析出,样品提取液中基本不含脂肪，从而消除脂肪对实验方法的干扰。

2. 4 标准曲线的制备

分别配制0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20mg/ml浓度的苯甲酸、山梨酸标准溶液进行分析,根据峰面积和浓度关系绘制标准曲线,得到苯甲酸、山梨酸的回归方程。苯甲酸回归方程: Y = 2.865×106X+2131,r=0. 9996;山梨酸回归程:Y=2.269×106X+2250,r =0. 9994。标准系列浓度在0. 01～0. 20mg/ml范围内呈良好的线性关系。苯甲酸、山梨酸检出限（S/N = 3）均为2.0mg/kg。

2. 5 方法精密度和回收率实验结果

取已测定含量的火腿肠样品,分别添加高、中、低三种不同浓度的苯甲酸、山梨酸标准液,按本方法进行提取,各进行6次测定,结果见表。

五 结果

采用本方法处理火腿肠样品,可有效改变火腿肠样品在均质后黏稠成块的现象,使样品均匀分散在提取液中,达到提高结果回收率的目的。在碱性条件下加入亚铁和乙酸锌可有效沉淀分离样品中含有的蛋白质、脂肪、淀粉等基质,沉淀剂不干扰苯甲酸、山梨酸测定,样品滤液无悬浮物质起到保护色谱柱,延长色谱柱使用寿命作用。本方法回收率在90. 9%～95. 1%之间, RSD在1. 26% ～3. 25%之间,标准系列浓度在0. 01～0. 20mg/ml范围内呈良好的线性关系,*方法分析的要求,适宜在日常检测工作中应用。