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ELISA试剂盒检测中样品的处理

北京华夏远洋科技有限公司

2013/10/2 23:23:47
  1.细胞培养物上清:
  
  细胞培养物于室温1000g,离心10分钟后收集上清,并将标本保存于-20℃,且应避免反复冻融。
  
  2.血清:
  
  标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g,4℃离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。
  
  3.血浆:
  
  可用EDTA或肝素作为抗凝剂标本采集后30分钟内于2-8℃,1000g离心15分钟,或将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融。
  
  4.尿液:
  
  无菌收集取初尿,离心除去沉淀物,即可用于检测,要长期保存尿样,可以加入0.05%的NaN3在4-8℃保存,或加入尿样冰冻保护液放入-20℃冰箱长期保存。
  
  5.组织匀浆:
  
  将组织标本先用PBS洗涤,除去多余血液,匀浆化后放在PBS于-20℃放置过夜,再经过二次反复冻融破膜,5000g,4℃离心5分钟,取上清即可检测。
  
  ELISA法定量检测人细胞液、体液以及组织匀浆中8羟基脱氧鸟苷的含量。
  
  试剂组成:包被平底微孔板,酶结合物,生物素,标准品,显色剂A,显色剂B,终止液,浓缩洗涤液(100倍稀释),使用说明书
  
  自备物品
  
  1.酶标仪(尽量提前预热)
  
  2.微量加液器、吸头
  
  3.蒸馏水或去离子水以及滤纸
  
  样本的采集及保存
  
  一般的生物标本包括有:
  
  血液、体液、内脏器官、粪便、胃液、活检组织、组织提取液、天然孔分泌物及各种表达系统的表达产物等
  
  一般为无菌操作,低温保存(-80℃、液氮)
  
  一.如果采集的实质器官则要求:
  
  1、器官实质不能太小
  
  2、以采集实质性病灶区为佳:如淋巴结、心脏、非、肺、脾以及肠管等病毒、病菌聚集的地方为佳
  
  3、同一病例装入同一容器,并做好标记
  
  4、应在0-8℃的低温储存和运输
  
  5、实质性器官的处理:
  
  5.1、取实质性器官约0.5mg左右,充分剪碎或研磨
  
  5.2、加入约500ul的PBS/生理盐水,充分混匀
  
  5.3、离心5000rmpx10min,去上清
  
  5.4、-20℃保存,作为待检标本(切勿反复冻融)
  
  二.体液(常见的包括血清、血浆、唾液以及尿液等)的处理方式
  
  1、血液包括血浆和血清,它们的主要区别就是:血清凝血而血浆不凝血,所以它们的处理方式也就不一样
  
  1.1、采集血浆时一般不加抗凝剂(主要为枸橼酸盐和柠檬酸盐),采集后立即离心800-1000rmpx5min分离,取上清,-20℃或4℃保存备用;
  
  1.2、如要采集血清,一般要加入总体积1%的抗凝剂,采集后先室温或4℃静置半小时后,800-1000rmpx5min分离,取上清,-20℃或4℃保存备用;
  
  2、胃液和唾液的采集方式一般现采现用,但是一般饭后半小时内不易采集,因为刚进食的唾液中富含丰富的唾液淀粉酶,的采集的时间时空腹采集;
  
  3、尿液的采集方式基本和唾液一样的,即现采现用,但是一般隔夜尿不采集;
  
  4、组织提取液如肺泡灌洗液等,采集后离心分离,800-1000rmpx5min,取上清,-20℃或4℃保存备用;
  
  三.粪便以及天然孔排泄物:采集后一般现用PBS/生理盐水溶解,充分混匀,800-1000rmpx5min分离,取上清,-20℃或4℃保存备用;
  
  四.活检组织一般进行穿刺检测,zui常见的就是肝活检,像病毒性肝炎、脂肪肝、各种类型的肝硬化等进行活检简单方便、准确。
  
  三、表达产物的检测
  
  (一)真核表达产物
  
  1、细胞上清(分泌性蛋白)
  
  1.2、贴壁细胞或半贴壁,直接将细胞培养上清吸出,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;
  
  1.2、不贴壁细胞,将培养基和细胞转移至10ml离心管,500-800rmpx10min,吸取上清至另一10ml离心管中,10000rmpx10min,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;
  
  2、细胞裂解物(非分泌性蛋白)
  
  2.1、贴壁细胞或半贴壁,直接将细胞培养上清吸出,然后用001MPBS(pH7.4)将细胞吹下至10ml离心管,500-800rmpx10min,弃上清,沉淀转移至1.5ml离心管中,DDW重悬,置冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;
  
  2.2、不贴壁细胞,将培养基和细胞转移至10ml离心管,500-800rmpx10min,弃上清,沉淀移至另一10ml离心管中,0.01MPBS(pH7.4)重悬,500-800rmpx10min,弃上清,沉淀移至1.5ml离心管中,DDW重悬,置冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;
  
  (二)原核(大肠杆菌表达系统)表达产物
  
  1、表达上清(非融合性蛋白)
  
  直接将培养物和上清吸出,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;
  
  2、菌体裂解物(融合性蛋白)
  
  直接将培养物和上清吸出,10000rmpx10min,弃上清,沉淀用PBS洗一遍,500-800rmpx10min,弃上清,DDW重悬沉淀,冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解,10000rmpx10min,取上清,-20℃或4℃保存,作为标本进行检测,如有需要可进行透析或纯化处理;

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