RT-PCR（AMV）试剂盒

产品简介

RT-PCR（AMV）试剂盒用于在总RNA、mRNA等RNA模板的基础上反转录产生cDNA*链，然后通过PCR反应扩增cDNA的全过程试剂盒。本试剂盒包含了进行cDNA*链合成和PCR反应所需的各种试剂。可用于检测mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA 断。试剂盒提供了Oligo(dT)18和随机引物这两种引物，前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录，后者进行反转录时不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA*链的合成。同时还提供了PCR反应的阳性对照β-actin的上、下游引物。

试剂盒以外自备仪器和试剂
无RNase酶的1.5m L离心管，可调移液器，PCR仪，无RNase的无菌水，设计好的目的基因引物。

保存条件：

-20℃保存，一年有效。

注意事项：

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作规程

  A、RT反应

1、 使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s。

2、 取灭过菌且无核酸酶的0.2ml PCR管，参考如下表格设置反转录反应（20 μL反应体系）：

3、   轻轻混匀(可以用Vortex在zui低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀)，随后2000rpm离心20s沉淀液体。

4、   如果使用Oligo(dT)18作为引物或使用基因特异性引物，在42℃孵育60分钟。如果使用随机引物作为引物，先在25℃孵育10分钟，随后在42℃孵育60分钟。注意：对于GC含量比较高的RNA模板的反转录反应，可以设置为45℃孵育60min。

5、   70℃孵育10min以失活逆转录酶并终止反转录反应。

6、   反转录产物可以直接用于下一步的PCR反应，也可以-20℃冻存以备以后使用。

B、PCR反应（50μL体系）

（如客户需要使用更小量的反应体系，试剂加样量按比例进行减少）：

1、   使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s。

2、 取灭过菌的0.2ml PCR管，参考如下表格设置反转录反应（50 μL反应体系）：

（如果有多个类似的PCR反应，可以先配制大体积的包含水、buffer、dNTP和Taq酶的混合物，然后分装到各PCR反应管内。根据情况，有时混合物中也可以包括引物）

3、   轻轻混匀(可以用Vortex在zui低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀)，随后2000rpm离心20s沉淀液体。

4、   如果所使用的PCR仪有热盖则省略本步骤。如果PCR仪没有热盖，则在管内滴入一滴矿物油。

5、 各设置好的PCR反应管置于PCR仪上，开始PCR反应。

a、  ,   PCR扩增条件参考：

  Step1(起始变性)：    94℃ 3min

Step2(变性)：        94℃ 30sec

Step3(退火)：        45～65℃ 30sec

Step4(延伸)：        72℃ 1min

Step5(循环)：        Go To Step2 for 25～35 cycles

Step6(zui终延伸)：    72℃ 10min

Step7(临时保存)：    4℃ forever

b、   PCR反应的设置需根据模板、引物、PCR产物的长度和GC含量等条件的不同设定不同的PCR反应条件包括温度、时间、循环数及镁离子的浓度等。

c、 Step4(延伸)的时间设置需根据PCR产物的长度进行设置，通常每kb产物的延伸时间为1分钟。例如PCR产物的长度为1kb，则延伸时间可以设置为1分钟，PCR产物的长度为2kb，则延伸时间可以设置为2分钟，以此类推。

d、 对于初次进行的PCR，为尽量确保可以扩增出预期的PCR产物，可以把循环数设置为35。对于需进行半定量或定量的PCR反应循环数一定要进行适当优化，使PCR反应没有达到平台期。

6、   反应结束后，取反应液10μL进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。

RT-PCR（AMV）试剂盒

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RT-PCR（AMV）试剂盒

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