一步法RT-PCR（AMV）试剂盒

产品简介

一步法RT-PCR（AMV）试剂盒用于在总RNA、mRNA等RNA模板的基础上反转录产生cDNA*链，然后通过PCR反应扩增cDNA的全过程试剂盒。本试剂盒采用了一步反应法完成整个RT-PCR反应，即RNA－cDNA－PCR反应操作在同一反应体系中进行，反应过程中不需增加额外的步骤，就可完成整个RT-PCR反应。可用于检测mRNA的表达水平、克隆特定基因的cDNA断。同时还提供了PCR反应的阳性对照β-actin的上、下游引物。

试剂盒以外自备仪器和试剂
无RNase酶的1.5m L离心管，可调移液器，PCR仪，无RNase的无菌水，设计好的目的基因引物。

保存条件：

-20℃保存，一年有效。

注意事项：

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

操作规程

1、 使用前每个组份轻轻混匀，然后2000rpm离心20s。

2、 取灭过菌且无核酸酶的0.2ml PCR管，参考如下表格设置反转录反应（50 μL反应体系）：

3、   轻轻混匀(可以用Vortex在zui低速度轻轻混匀或用移液器吹打混匀)，随后2000rpm离心20s沉淀液体。

4、   各设置好的PCR反应管置于PCR仪上，开始RT-PCR反应。

a、     RT反应条件：

42℃保温1 hr

b、   PCR扩增条件参考：

  Step1(起始变性)：    94℃ 3min

Step2(变性)：        94℃ 30sec

Step3(退火)：        45～65℃ 30sec

Step4(延伸)：        72℃ 1min

Step5(循环)：        Go To Step2 for 25～35 cycles

Step6(zui终延伸)：    72℃ 10min

Step7(临时保存)：    4℃ forever

c、    PCR反应的设置需根据模板、引物、PCR产物的长度和GC含量等条件的不同设定不同的PCR反应条件包括温度、时间、循环数及镁离子的浓度等。

d、 Step4(延伸)的时间设置需根据PCR产物的长度进行设置，通常每kb产物的延伸时间为1分钟。例如PCR产物的长度为1kb，则延伸时间可以设置为1分钟，PCR产物的长度为2kb，则延伸时间可以设置为2分钟，以此类推。

e、 对于初次进行的PCR，为尽量确保可以扩增出预期的PCR产物，可以把循环数设置为35。对于需进行半定量或定量的PCR反应循环数一定要进行适当优化，使PCR反应没有达到平台期

5、   反应结束后，取反应液10μL进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。

一步法RT-PCR（AMV）试剂盒

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一步法RT-PCR（AMV）试剂盒

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