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BC5985-100T/96S 丁酰胆*酯酶抑制剂活性检测试剂盒 微量法
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- BC5985-100T/96S
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北京索莱宝科技有限公司
（Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. ）是一家从事生物学试剂及试剂盒的高科技生物企业。
总部位于北京，并在设有经销或代理机构。产品因可靠而稳定的质量和较为完善的售后服务确立了“Solarbio”良好的品牌形象。公司秉承“以客户为中心、以产品为保障、以诚信为基础、以创新为宗旨”的发展理念，拥有专业的研发和质量检测团队以及的仓储和物流系统。“Solarbio”已经得到科研工作者的认可，成为广大经销商推崇的。
公司拥有一批专业的研发人员，我们专注于生物产品的不断完善和创新。产品覆盖面广，品质可靠。先后开发了涵盖分子生物学、细胞生物学、免疫学、生物医学等领域的多种试剂及试剂盒。同时，索莱宝公司提供各种常规生化试剂，库存常备产品多达10000多种，可随时为广大科研工作者提供各类专业试剂。在质量方面，索莱宝谨记公司信念：质量高于一切。所有研发的产品都设有严谨的生产流程，科学的质量检测方法和成熟的质量检测程序，我们恪守对每一位用户的承诺：用专业的态度做专业的品牌。同时，公司组建了一支专业的技术服务队伍，能够为科研工作者提供专业的技术服务。每一位购买索莱宝产品的用户都能够得到专业的咨询和完善的售后服务。
索莱宝公司坚持与接轨，注重和企业的合作与交流，并提供产品代理、市场咨询等多项服务。公司将一如既往与世界更多合作，不断为广大生物科研工作者提供更优质的产品和服务。公司理念：“为科研服务，为生命尽责”。一个人能够走多远，取决于与谁同行。索莱宝公司期待与各同行精诚合作。
索莱宝诚招生物试剂研发人员，期待与广大同行精诚合作，为广大科研工作者提供优质的产品，高效的物流以及专业的售后服务。索莱宝感谢所有朋友的支持与帮助，您的支持是我们前进的动力和保障。让我们携手同行，共同创造美好的明天。
详细信息
丁酰胆*酯酶抑制剂活性检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC5985
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体120 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1支 | -20℃保存 |
试剂二 | 液体15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体12 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂五 | 液体1 mL×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1. 试剂一：临用前加入1.2mL蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂-20℃分装后可保存4周，避免反复冻融该试剂为冻干试剂，可能存在不同瓶间肉眼观察试剂量相差较大甚至量很少的现象，此现象不影响使用，实际质量相同。
2. 试剂四：临用前加入6mL试剂二，充分溶解，用不完的试剂-20℃可分装保存4周，避免反复冻融。
3. 试剂五：10mmol/L利凡斯的明溶液。临用前取15μL 10mmol/L利凡斯的明溶液，加入985μL蒸馏水，配制成0.15mmol/L利凡斯的明溶液，现用现配（此试剂用于阳性管实验，选做）。
产品说明：
丁酰胆*酯酶（Butyrylcholinesterase，BchE，EC3.1.1.8），又称血浆*碱酯酶，假性胆*酯酶，是一种丝*酸水解酶，由肝脏合成后进入血液，几乎存在于所有动物组织中。与乙酰胆*酯酶（AchE）相比，BchE能够有效水解较大的胆*酯，如丁酰胆*和苯甲酰胆*，而且可以清除有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药等神经毒剂的毒害作用。有研究表明，BchE可作为阿尔茨海默病治疗的重要靶点，BchE抑制剂被用于改善阿尔茨海默病患者记忆力减退、认知功能障碍等病征。
BchE催化丁酰胆*水解生成*碱，胆*与二硫代硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB），BchE抑制剂通过抑制BchE活性，减少丁酰胆*的水解。TNB在412nm处有吸收峰，可通过测定412nm处吸光度的变化，计算BchE抑制剂活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、天平、烘箱、粉碎仪/研钵/匀浆器、30-50目筛、超声清洗仪、离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织样本：将样本烘干至恒重，粉碎，过30-50目筛之后，称取约0.1g，加入1mL提取液，用超声提取法进行提取，超声功率300W，60℃，提取30min。12000rpm，25℃，离心10min，取上清，用提取液定容至1mL，待测。
2. 粉剂样本：称取适量样本，加入适量提取液，配制成适宜浓度的溶液待测。
注：若粉剂样本不溶于提取液，可先用合适的溶剂溶解，配制成100×或者更大浓度的溶液，再用提取液稀释至1×浓度。
二、 测定步骤
1．可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计蒸馏水调零。
2．操作表：（在微量玻璃比色皿/96孔板中加入下列试剂）
试剂名称（µL） | 空白管1 | 空白管2 | 测定管 | 阳性管（选做） |
试剂一 | 10 | - | 10 | 10 |
试剂二 | 50 | 60 | 50 | 50 |
提取液 | 10 | 10 | - | - |
样本 | - | - | 10 | - |
试剂五 | - | - | - | 10 |
混匀，25℃避光孵育10min | ||||
试剂三 | 100 | 100 | 100 | 100 |
试剂四 | 50 | 50 | 50 | 50 |
充分混匀，于412nm处测定10s时的吸光值A，迅速置于37℃准确反应5min（若酶标仪带有控温功能，将温度调至37℃），测定5min10s时的吸光值A’，分别记为A空白1、A空白2、A测定、A阳性和A’空白1、A’空白2、A’测定、A’阳性，计算ΔA空白=（A’空白1-A空白1）-（A’空白2-A空白2），ΔA测定=（A’测定-A测定）-（A’空白2-A空白2），ΔA阳性=（A’阳性-A阳性）-（A’空白2-A空白2）。空白管1和空白管2只需做1-2次。 | ||||
三、丁酰胆*酯酶抑制剂活性计算
1. 抑制率计算
丁酰胆*酯酶抑制剂
抑制率（%）=（ΔA空白-ΔA测定）÷ΔA空白×100%。
2. IC50计算
IC50，即抑制剂半抑制浓度。对于确定对BchE有抑制作用的样本，可配制成适当的浓度梯度，分别以样本浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标作抑制曲线，以此计算得到抑制率为50%时的样本浓度，即IC50。
注意事项：
1. 为保证实验结果的准确性和稳定性，请严格控制反应时间和操作时间。
2. 样本吸光度大于1.6或ΔA测定接近ΔA空白时，建议在样本处理步骤增加组织样本比例或将粉剂样本配制成更高浓度的溶液再进行测定。当ΔA测定小于0.004时，可以将样本用提取液稀释后再进行测定。
3. 若用于比较不同试剂、提取物、药物或组织对BchE的抑制程度，必须将试剂、提取物、药物或组织匀浆配制成相同浓度进行比较。
实验实例：
1. 取0.1005g柚果皮样本（烘干），加入1mL提取液进行超声提取，离心后取上清，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA空白=（A’空白1-A空白1）-（A’空白2-A空白2）=（1.129-0.133）-（0.141-0.120）=0.975，ΔA测定=（A’测定-A测定）-（A’空白2-A空白2）=（0.878-0.337）-（0.141-0.120）=0.520，计算抑制率得：
BchE抑制剂抑制率（%）=（0.975-0.520）÷0.975×100%=46.667%。
2. 取0.1014g柿果皮样本（烘干），加入1mL提取液进行超声提取，离心后取上清，稀释16倍后按照测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA空白=（A’空白1-A空白1）-（A’空白2-A空白2）=（1.129-0.133）-（0.141-0.120）=0.975，ΔA测定=（A’测定-A测定）-（A’空白2-A空白2）=（0.581-0.127）-（0.141-0.120）=0.433，计算抑制率得：
BchE抑制剂抑制率（%）=（0.975-0.433）÷0.975×100%=55.590%。
3. 取10μL 0.15mmol/L利凡斯的明溶液，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA空白=（A’空白1-A空白1）-（A’空白2-A空白2）=（1.129-0.133）-（0.141-0.120）=0.975，ΔA测定=（A’测定-A测定）-（A’空白2-A空白2）=（0.631-0.126）-（0.141-0.120）=0.484，计算抑制率得：
BchE抑制剂抑制率（%）=（0.975-0.484）÷0.975×100%=50.359%。
参考文献：
[1] Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr. et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity [J]. Biochemical Pharmacology, 1961, 7(2): 88-95.
[2] Noor Atatreh, Sara Al Rawashdah, Shaikha S Al Neyadi. et al. Discovery of new butyrylcholinesterase inhibitors via structure-based virtual screening [J]. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2019, 34(1): 1373-1379.
[3] Li Q, Chen Y, Xing S. et al. Highly Potent and Selective Butyrylcholinesterase Inhibitors for Cognitive Improvement and Neuroprotection [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 64(10): 6856-6876.
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