线粒体呼吸链复合体Ⅲ/CoQ-细*色素C还原酶活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC3245
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 工作液的配制：临用前取1支试剂二转移到1瓶试剂一中混合溶解（约62T），用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融。

产品说明：
线粒体复合体Ⅲ（EC 1.10.2.2）又称CoQ-细*色素C还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ的氢传递给细*色素C，生成还原型细*色素C。
与氧化型细*色素C不同，还原型细*色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
实验中所需仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯材质）、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料”附件
注意事项：

1. 尽量保持比色皿内反应液温度在37℃或25℃。可以在记录初始吸光度A1后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应2分钟，之后迅速取出比色皿并擦干，记录2min时的吸光度。

2. 当测定吸光值大于1时，建议将样本用提取液稀释后测定，计算公式中注意乘以稀释倍数。

3. 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

4. 由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量(单独测定)。

5. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

6. 本试剂盒试剂足够完成100管反应。

7. 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为100T/24S）

A、上清中复合体Ⅲ活力的计算:
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol还原型细*色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活力(U/g 质量)=[ΔA1×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样)÷T=262×ΔA1÷W
ΔA1：上清测定值；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：细*色素C摩尔消光系数，1.91×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V提取：加入提取液体积，1.0mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
B、沉淀中复合体Ⅲ活力的计算:
单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol还原型细*色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活力(U/g 质量)=[ΔA2×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样)÷T=52×ΔA2÷W
ΔA2：沉淀测定值；V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：细*色素C摩尔消光系数，1.91×10⁴L/mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V提取：加入提取液体积，0.2mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。
C、样本复合体Ⅲ总活力的计算:
样本复合体Ⅲ总活力即为上清中复合体Ⅲ活力与沉淀中复合体Ⅲ活力之和。
复合体Ⅲ（U/g 质量）=262×ΔA1÷W +52×ΔA2÷W
D、以96孔板计算：
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。
实验实例：

1. 取0.1g兔子肾脏进行样本处理，将复溶后的沉淀稀释2倍后按照测定步骤操作，使用微量玻璃比色皿测得计算ΔA=（A2测定-A1测定）-（A2对照-A1对照）=（0.9921-0.9077）-（0.9664-0.9419）=0.0599，按样本蛋白浓度计算得：

复合体Ⅲ（U/mg prot）=262×ΔA÷Cpr×2（稀释倍数）=262×0.0599÷2.56×2（稀释倍数）=12.26 U/mg prot。
相关发表文献：

1. Ming Song,Fangfang Chen,Yihui Li,et al. Trimetazidine restores the positive adaptation to exercise training by mitigating statin-induced skeletal muscle injury. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. November 2017;(IF10.754)

2. Liuqin He,Haiwen Zhang,Xihong Zhou. Weanling Offspring of Dams Maintained on Serine-Deficient Diet Are Vulnerable to Oxidative Stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. September 2018;(IF4.868)

3. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018;(IF4.259)

4. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2019, 134: 229-238.

5. Bao Z, Xu X, Chao H, et al. ERK/Nrf2/HO-1 pathway-mediated mitophagy alleviates traumatic brain injury-induced intestinal mucosa damage and epithelial barrier dysfunction[J]. 2017.

参考文献：

1. Luo C, Long J, Liu J. An improved spectrophotometric method for a more specific and accurate assay of mitochondrial complex III activity[J]. Clinica Chimica Acta, 2008, 395(1-2): 38-41.

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