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货号：YJ1174 规格：100管/48样
Ca++ Mg++-ATP 酶活性测定说明书
微量法
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
Ca++ Mg++-ATP 酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成ADP和无机磷。
测定原理：
根据Ca++ Mg++ -ATP 酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性高低。
需自备的仪器及用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入6mL蒸馏水充分混匀待用；用不完的试剂 4℃保存一周；
试剂三：液体 2mL×1 瓶，4℃保存。
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。用时加入3mL蒸馏水， 4℃保存。
试剂五：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。
试剂六：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。
试剂七：液体25mL×1 瓶，室温保存。
试剂八：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μmol/mL标准磷应用液配制：将试剂八20倍稀释，即取0.1mL试剂八加1.9mL蒸馏水充分混匀。
定磷剂的配制：按 H2O: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂建议用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
样品酶液的制备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
操作步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）
| 对照管 | 测定管 |
试剂一（μL） | 65 | 45 |
试剂二（μL） | 60 | 60 |
试剂三（μL） |
| 20 |
样本 （μL） |
| 100 |
混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）准确水浴 10min | ||
试剂四（μL） | 25 | 25 |
样本 （μL） | 100 |
|
混匀，8000g，25℃离心 10min，取上清液
3、定磷（在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂）
| 空白管 | 标准管 | 对照管 | 测定管 |
0.5μmol/ml标准磷应用液（μL） |
| 20 |
|
|
上清液（μL） |
|
| 20 | 20 |
蒸馏水（μL） | 20 |
|
|
|
定磷试剂（μL） | 200 | 200 | 200 | 200 |
混匀，室温放置30min，在660nm处，记录各管吸光值。
注意事项：
1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒100管只能测48份 Ca++ Mg++-ATP酶。
2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是
检测成败的关键。
3、空白管和标准管只要做一管。
Ca++ Mg++-ATPase 活力的计算：
1、血清（浆）Ca++ Mg++-ATPase 活力的计算:
定义：每小时每毫升血清（浆）中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP产1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP 酶活力（μmol/h/mL）= [C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷V 样÷T=7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）
2、组织、细菌或细胞中Ca++ Mg++-ATPase 活力的计算：
（1）按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/mg prot)= [C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A 标准管-A空白管）÷（V样×Cpr）÷T =7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力
单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(W× V样÷V样总)÷T=7.5×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每1万个细菌或细胞中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /104cell)= [C标准管×V总]×（A测定管-A对照管）÷（A 标准管-A空白管）÷(500×V样÷V样总)÷T=0.015×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.25mL；V 样：加入样本体
积，0.1mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6 小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
