AxyPrep 无内毒素质粒大量试剂盒

本试剂盒采用 SDS 碱裂解法，结合 DNA 制备膜选择性吸附 DNA。同时采用特殊溶液（Buffer ETR 和 Buffer PF）有效去除内毒素，可从 80-200 ml 细菌培养物中提取出多至 500 礸 高纯度质粒 DNA，其内毒素水平控制在 0.1 EU/礸 以下。

一、 试剂盒组成、贮存、稳定性

RNase A：50 mg/ml，室温可贮存 6 个月，长期贮存于-20℃。
Buffer S1：细菌悬浮液。加入 RNase A 后，混合均匀，4℃贮存。
Buffer S2：细菌裂解液（含 SDS/NaOH），室温密闭贮存。
Buffer S3K：中和液，室温密闭贮存。
Buffer B：DNA 结合溶液，室温密闭贮存。
Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前，按试剂瓶上的体积加入无水乙醇（可用无水乙醇或 95%
乙醇）。混合均匀，室温密闭贮存。
ET-free water (70% Ethanol)：使用前，按试剂瓶上的体积加入无水乙醇（可用无水乙醇或 95%
乙醇）。混合均匀，室温密闭贮存。
Eluent A：洗脱液。室温密闭贮存。
Buffer ETR：内毒素去除液。室温密闭贮存。

二、 注意事项

1.细菌过量将影响细菌裂解、质粒 DNA 的释放，导致内毒素含量过高。

2.步骤 3 和步骤 4 的操作必须温和。剧烈摇晃将导致基因组 DNA 的污染。但混合必须充分，否则影响得率。

3.在加入 Buffer S3K 时，蛋白质和基因组 DNA 形成粘稠的白色絮状沉淀，必须充分混合均匀，使凝集块中间也得到充分中和凝结。

4.Buffer S2、Buffer S3K、Buffer B 和 Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和防护眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣物，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。

三、 实验准备

1.*次使用前，RNase A 全部加入 Buffer S1 中，4℃贮存。

2.*次使用前，Buffer W2 concentrate 中加入体积的无水乙醇。

3.*次使用前，ET-free water (70% Ethanol)中加入体积的无水乙醇。使用前置于-20℃预冷。

4.使用前，检查 Buffer S2 是否出现沉淀，如出现沉淀，应于 37℃温浴加热溶解并冷却至室温后使用。

5.Eluent A 在 65℃预热后使用，有利于提高质粒得率。

6.Buffer S3K、Buffer B 和 Buffer ETR 使用前置于 4℃预冷。

7.准备无核酸和核酸酶污染的 Tip 头、50ml 离心管。

8.水平离心机（转速可达到 4,000×g）及冷冻离心机（转速可达到 8,000×g）

9.准备 56℃水浴。

Buffer PF：分相缓冲液。室温密闭贮存。

四、 操作步骤

1.取 80-200 ml 在 LB 培养基中培养过夜的菌液（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），3,000 ×g 离心 8 min，弃上清。将离心管倒置于纸巾上 1 min，除尽上清。
一般过一夜培养的菌液 OD600 在 2.0-4.0 之间。若菌液 OD600 >4，菌量需减少。

2.加 10 ml Buffer S1，悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。

确认 Buffer S1 中已加入 RNase A。

3.加 10 ml Buffer S2，温和并充分地上下翻转混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过 5 min。
Buffer S2 使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH，降低溶菌效率。
避免剧烈摇晃，否则将导致基因组 DNA 污染。
此步骤不宜超过 5 min。

4.加 10 ml 4℃预冷的 Buffer S3K，温和并充分地上下翻转混合，直至溶液颜色均一并形成紧实的凝集块，室温放置 5 min。
加入 Buffer S3K 后应立即混合，以避免形成局部的凝结块。

避免剧烈摇晃，否则将导致基因组 DNA 污染。

5.加 10 ml 4℃预冷的 Buffer B，温和并充分地上下翻转混合 10 次，8,000×g 离心（4℃）10 min。

步骤 6-9 可以选择离心法或负压法。

A.离心法：

6A. 先将大量制备管放入 50 ml 离心管中。吸取步骤 5 中的混合液，转移到大量滤器（Maxiprep

syringe filter）中。

7A. 插入推杆，垂直向下缓慢将滤液推注至大量制备管中，≥6,000×g 离心 5 min。 8A. 弃滤液，加 12 ml Buffer W1 至制备管中，≥6,000×g 离心 5 min。
9A. 弃滤液，加 14 ml Buffer W2 至制备管中，≥6,000×g 离心 5 min。

确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的体积加入无水乙醇。

B.负压法：

6B. 正确连接负压装置，将大量制备管插到负压装置的插口上。

7B. 吸取步骤 5 中的上清液，转移到大量滤器中，插入推杆，垂直向下缓慢将滤液推注至大量制备管中，开启并调节负压至-25 ~ -30 英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。

8B. 保持负压，加 12 ml Buffer W1，吸尽管中溶液。

9B. 保持负压，加 14 ml Buffer W2，吸尽管中溶液。

确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的体积加入无水乙醇。

10.再在大量制备管中加 4 ml Buffer W2，≥6,000×g 离心 5 min。

11.将制备管置于另一洁净 50 ml 离心管中，在制备管膜中央加 2 ml Eluent A，室温静置 5 min，≥6,000

×g 离心 5 min 收集质粒 DNA。

将 Eluent A 加热至 65℃将提高洗脱效率。

12.弃制备管。在滤液中加入 4 ml 预冷的 Buffer ETR，混合均匀。

如果 Buffer ETR 浑浊，于冰上静置，直至溶液变得清亮；如果分层，则混合均匀。

13.加入 1 ml Buffer PF，混合均匀。

*溶液可能会出现微弱的浑浊现象，此为正常现象。

14.置于 56°C 孵育 8 min。室温 4,000×g 离心 5 min。

孵育后溶液将出现大量乳白色沉淀，否则延长孵育时间。

孵育后溶液有可能出现分层现象，此为正常现象。
此步骤的离心必须使用吊篮式（swing-out rotor）离心机或其他水平离心机

15.取无色上相至 50 ml 离心管中，加入 0.8 倍体积异丙醇（如：取得 6 ml 无色上相，则加入 4.8 ml 异丙醇），混合均匀。室温静置 10 min。8,000×g 离心 10 min。
16.尽可能弃尽上清。加入 2 ml 预冷的 ET-free water（70% Ethanol），洗涤沉淀，8,000×g 离心 5 min。

ET-free water（70% Ethanol）使用前确定已加入体积的无水乙醇。

17.尽可能弃尽上清。在超净台中干燥 10-15 min。

管壁上残留液体可短暂离心后吸弃。

18.加入 500 祃 Eluent A 或无内毒素水溶解质粒 DNA。

总抗氧化能力（total antioxidant capacity，t-aoc）试剂盒说明书