TRIeasy总RNA提取试剂(TRIeasy Total RNA Extraction Reagent)

TRIeasy^TM Total RNA Extraction Reagent是一种适用于各种动植物、细菌组织、细胞的总RNA抽提试剂，具有*的裂解能力，可在短时间内裂解细胞和组织样本，并有效抑制样本中RNA的降解，保持RNA的完整性。样品在该试剂中能够充分裂解，之后加入氯仿离心分层，形成上清层、中间层和有机层(鲜红色下层)，RNA分布在上层水相中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可得到总RNA。提取的总RNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组DNA，可直接用于Northern、点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RT-PCR、poly(A)+选择、RNA酶保护分析以及构建cDNA文库等多种分子生物学实验。

此外，样品中的DNA和蛋白也能以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，而在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

本品操作简单快速，所有操作可在一小时内完成。对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的裂解效果。

运输与保存方法

冰袋运输。4℃避光保存，有效期一年。

注意事项
1. 本产品中含有苯|酚，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会引起中毒、灼伤及其他身体伤害。使用时应穿戴防护物，如防护|服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触到眼睛时，应立即用大量的水冲洗并前往医院治疗。

2. 请穿实验服并佩戴一次性手套操作，避免RNase污染。

3. 需自备氯仿、异丙醇（新开封或提取RNA专用）、75%乙醇 (DEPC处理水配制)、DEPC和DEPC处理水。

4. 样品用Total RNA Extraction Reagent匀浆后，如果不加入氯仿进行下游实验，可先-70℃冻存，可保存一个月以上。

5. RNA沉淀在75%乙醇中，4℃可保存1周，-20℃可保存1年。

6. RNA半衰期比较短，易降解，建议抽提后尽快进行后续实验。

参考用量

表1 每毫升Total RNA Extraction Reagent能够充分裂解的最大样本量

注：过多的样本量可能会导致裂解不充分，并使产物纯度降低。

操作流程

1. 样品的处理

1) 样品匀浆

A. 贴壁细胞

弃去培养液，直接往直径3.5 cm的培养板中加入1 mL Total RNA Extraction Reagent，覆盖并反复吹打裂解细胞。

注：1. 依据培养板的面积而不是细胞的数量来决定Total RNA Extraction Reagent的所需量（每10 cm2 加1 mL）。

2. 加入Total RNA Extraction Reagent量不足时，会导致DNA污染。

3. 贴壁细胞往往不能*从培养瓶（皿）脱落，这并不意味着裂解不*。此时，细胞膜实际已*裂开，并释放RNA，继续后续实验即可。

B. 悬浮细胞

离心收集细胞沉淀，每5×106-1×107个细胞加入1 mL Total RNA Extraction Reagent，用移液器反复吹打。

注：加入Total RNA Extraction Reagent前应避免洗涤细胞，否则会增加mRNA降解的可能性。裂解某些酵母和细菌可能需要使用匀浆器。

C. 动、植物组织

取-70℃冻存动物组织在液氮中充分研磨，按照表1加入适当量Total RNA Extraction Reagent混匀。或取新鲜动植物组织尽量剪碎，加入适当量Total RNA Extraction Reagent，匀浆仪进行匀浆处理。

注：样品体积不要超过加入Total RNA Extraction Reagent体积的10%。

2) 将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置5分钟以使核蛋白体*解离。

3) （可选）4℃，12000 g 离心10 min，取上清。

注：离心可去除样品中较多蛋白质、脂肪、多糖或肌肉，植物的块茎结节等。离心后的沉淀中包含有细胞外膜、多糖以及高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂应尽量去除，取澄清的匀浆液进行后续实验。

2 总RNA提取
1) 向上述裂解液中加入1/5体积氯仿（如每1 mL Total RNA Extraction Reagent加入0.2 mL氯仿）。盖紧离心管盖，剧烈震荡15 sec，室温静置2-3 min。

2) 4℃，12000 g 离心10-15 min。

注：1. 离心后混合物可分3层：上层无色水样层，中间层，下层红色有机苯|酚氯仿层。RNA存在于水样层中。
      2. 上层容量约为所加Total RNA Extraction Reagent总量的50-60%。如加入1 mL Total RNA Extraction Reagent，上层水相约为500-600 μL。建议吸取400-500 μL，以防吸到中间层造成DNA污染。
      3. 有机相和中间层是蛋白和DNA，可用于后续抽提。
3) 小心吸取上层水相至新离心管中，加入1/2体积异丙醇（如每1 mL Total RNA Extraction Reagent加入0.5 mL 异丙醇）。颠倒混匀后室温放置10 min。

4) 4℃，12000 g 离心10 min。

注：RNA沉淀在离心前通常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
5) 小心弃去上清，加入等体积 75%乙醇（DEPC水配制，如每1 mL Total RNA Extraction Reagent加入1 mL 75%乙醇）。涡旋充分洗涤，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来。

6) 4℃，7500 g 离心5 min，弃上清，注意不要丢失RNA沉淀。

注：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸到沉淀。

7) 室温放置空气干燥5-10 min。加入30-100 μL 无RNase水溶解RNA，待*溶解后，取少量检测，其余溶液-70℃保存。

注：RNA沉淀不能*干燥，过分干燥会导致RNA溶解度降低。

3 产物检测

A. RNA完整性检测

1) 取1 μL RNA加入适当RNA loading buffer，混匀。

2) 进行电泳检测。若出现清晰的三条带，证明RNA完整性较好。

B. RNA纯度检测

检测260 nm，280 nm OD值，并计算A260/A280比值。纯的RNA的比值应在2.0左右。

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