产品信息

产品描述

天然蛋白A（Protein A）是一种发现于金黄色葡萄球菌的细胞壁表面蛋白，天然蛋白G（Protein G）是一种分离自G型或C型链球菌属的细胞表面蛋白，二者功能相似，主要通过与免疫球蛋白（Ig）的Fc区相互作用，可结合大多数哺乳动物的IgG。然而两者结合特异性上有所不同（详细见附录1，蛋白A，G对不同物种Ig的结合能力总表），如蛋白G对人IgG3，大鼠IgG2a，绵羊IgG1具有很高的亲和力，但蛋白A对这些Ig结合力很弱。蛋白A，蛋白G常共价偶联在固体载体如琼脂糖珠或丙烯酸树脂小珠上，直接用以做免疫沉淀（IP）或者免疫共沉淀（Co-IP）来进行蛋白功能相关研究，或者直接装在层析柱上来纯化单克隆或者多克隆抗体。

本品使用的是基因改造后的蛋白A和蛋白G，不仅维持其本身的Ig亲和特性，同时也去除了天然蛋白本身的非主要结合域以降低非特异性结合。本品同时将蛋白A和蛋白G共价偶联到琼脂糖凝胶微球表面，比单独的蛋白A或者蛋白G都有更广的结合范围，适合于所有蛋白A琼脂糖珠和蛋白G琼脂糖珠单独可以结合的Ig，实用性更高。

产品性质

运输与保存方法

冰袋运输。4℃保存，2年有效。

需准备试剂

【注】：建议以下缓冲液在使用前用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。

结合/洗杂缓冲液：0.15M NaCl, 20mM Na₂HPO₄, pH7.0

洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸，pH 3.0

中和液：1M Tris-HCl，pH 8.5

交联缓冲液：0.2M 三乙醇胺，pH8.2

终止液：50mM Tris-HCl，pH 7.5

使用方法

一、免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）:

1蛋白样品的准备：

① 贴壁细胞：取10 cm细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤2次，然后加入500 µl至2 ml细胞裂解液裂解细胞（如RIPA裂解液）；

② 悬浮细胞：离心收集细胞后，PBS洗涤1次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解；

③ 动植物组织样本：参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解；

【注意】：a）具体的裂解方法，应参考不同裂解液的详细使用方法；b）不同量的细胞，应选用适当裂解液的用量进行裂解（如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或PBS适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量），通常裂解液zui终总蛋白浓度选择在0.5-1ug/ul范围内较合适；c）可选：细胞或组织处理时加入广谱核酸酶Benzonase（Yeasen Cat#20125），能够降解所有形式的DNA和RNA(单链、双链、线形和环状)，而无蛋白水解活性。此步操作可以降低背景，保障实验的可重复性。

2 去除非特应性结合（可选）：

① 取0.2-1 ml 细胞或组织裂解液，蛋白量约为0.2-1 mg，加入约1 µg和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20 µl充分重悬的Protein A/G Agarose Resin，4℃缓慢摇动30 min~2 h。

② 2500 rpm（约1000g）离心5min，取上清用于后续的免疫沉淀。

【注】：所谓种属相同的IgG是指与后续免疫沉淀用一抗宿主相同的正常IgG。此步骤可以预先去除样本与Protein A/G Agarose Resin的非特异性结合，降低背景。

3 免疫沉淀：

1）抗体吸附

① 取适量Protein A/G Agarose Resin加入到2ml离心管中，500rpm离心1min，吸弃上清。

② 加入0.5ml结合缓冲液重悬树脂，500rpm离心1min，吸弃上清。继续重复2次此操作。

③ 向上述已平衡树脂中加入抗体溶液，重悬树脂，室温下轻轻翻转离心管或置于翻转混合仪混匀30min后，500rpm离心1min，收集上清液，备用，待检测。

④ 向上述树脂中加入0.5ml的洗杂缓冲液，重悬树脂对其进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，500rpm离心1min，吸弃上清。再重复2次。

2）抗体交联（可选）

【注】：如需将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略此步骤。

① 向清洗过的树脂中加入1ml交联Buffer，500rpm离心1min，吸弃上清。

② 再向其中加入1ml 20mM DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)的交联Buffer，该试剂需现配现用，重悬树脂，室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转，促使Buffer 和树脂充分接触，30min后，500rpm离心1min，吸弃上清。

③ 再向其中加入1ml终止液，重悬树脂，终止交联反应，室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转15min，500rpm离心1min，吸弃上清。

④ 加入0.5ml洗杂缓冲液，重悬树脂，进行清洗，500rpm离心1min，吸弃上清。再重复2次。

3）沉淀反应

① 抗原吸附：向上述树脂-抗体溶液中加入含抗原的样品，用移液器轻轻吹打使抗原与树脂-抗体复合物分散均匀，室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转10min，使抗原与抗体充分结合，如结合力较弱则可在室温下反应1h或者在4℃下反应过夜。

② 洗杂：将上述完成抗原吸附的产物500rpm 离心1min，收集上清液置于冰上待检测。向离心管中加入1ml洗杂缓冲液，用移液器轻轻吹打使树脂-抗体-抗原复合物分散均匀，500rpm离心 1min，弃上清。重复2次，zui后加入1ml洗杂液，将树脂-抗体-抗原复合物转移至新的离心管中，500rpm离心1min，吸弃上清。

4 样品洗脱

【注】：根据后续检测的不同提供两种洗脱方法。

1） 变性洗脱：该方法适于SDS-PAGE检测。向上述离心管中加入25µl 1×SDS-PAGE loading buffer 混匀，95℃加热5min。500rpm 离心1min，收集上清进行后续WB分析。

2）非变性洗脱：该法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后续功能分析。具体做法：向上述沉淀反应得到的树脂-抗体-抗原复合物中加入5倍体积的洗脱Buffer，用移液器轻轻吹打数次，室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转10min，500rpm离心1min，吸取上清，收集洗脱组分，即为目标抗原，将其收集至新的离心管中，立即加入1/10体积的中和液，将洗脱组分PH调至7.0-8.0，备用。

二、免疫共沉淀 （Co-IP）

1 抗原抗体的结合：将抗体与含有目的蛋白的裂解液混合，室温孵育30-60min，或者4℃孵育过夜。

【注】：① 该步骤孵育时间取决于抗原与抗体的结合效率以及抗原的稳定性，需根据具体情况进行优化；② 抗体的加入量需参考后续加入树脂的量，抗体加入量过多会导致抗原-抗体混合物与树脂的结合。推荐抗体加入量为树脂80%的zui大载量。

2 树脂准备：

1）取适量Protein A/G Agarose Resin加入到2ml离心管中，500rpm离心1min，吸弃上清。

2）加入0.5ml结合Buffer 重悬树脂，500rpm离心1min，吸弃上清。继续重复2次此操作。

3 抗原-抗体混合物的吸附：将步骤1中抗原-抗体混合物加入到已处理的树脂中，混匀，室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转30min，使其充分接触并吸附，500rpm离心1min，收集上清留待检测。

4 洗杂：向上述离心管中加入0.5ml洗杂缓冲液，重悬树脂，去除非特异性结合，500rpm离心1min，吸弃上清。再重复2次此操作。

5 抗原洗脱（根据后续检测的目的提供两种抗原洗脱方法，同免疫沉淀法洗脱）

注意事项

1）请勿冷冻保存本产品。

2）Protein A/G琼脂糖珠使用前一定要充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。

3）所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

附录  蛋白A，G对不同物种Ig的结合能力总表（见下）

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