Yeasen/翌圣生物 品牌
生产厂家厂商性质
上海市所在地
线粒体红色荧光探针
¥425D-盐(D-Luciferin Potassium Salt)
面议MycAway支原体去除试剂(1000×)
面议TUNEL细胞凋亡检测试剂(tunel试剂盒)
面议TUNEL细胞凋亡检测试剂盒
面议Human Fibronectin 人纤维连接蛋白
面议Collagenase IV胶原酶IV型
面议D- 盐(D-Luciferin, Sodium Salt)
¥748FITC标记鬼笔环肽(FITC Phalloidin)
¥785TRITC Phalloidin 罗丹明标记鬼笔环肽
¥785支原体喷雾剂(即用型)
面议Polybrene 聚凝胺(10 mg/mL)
面议产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格(元) |
Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒 | 41303ES50 41303ES60 | 50T 100T | 8895.00 16425.00 |
产品描述
Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的Vero宿主细胞DNA残留片段含量的试剂盒。
本试剂盒采用PCR荧光探针原理,专一快速的检测Vero细胞的残留DNA,其检测限可以达到fg平。试剂盒配套有Vero DNA Control(DNA定量参考品)。本试剂盒需要与磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461/18462)配套使用。
产品组分
组分编号 | 组分名称 | 产品编号/规格 | |
41303ES50(50T) | 41303ES60(100T) | ||
41303-A | Vero qPCR mix | 0.8 mL | 1.6 mL |
41303-B | Vero Primer&probe mix | 200 μL | 400 μL |
41303-C | DNA Dilution Buffer | 2×2 mL | 4×2 mL |
41303-D | Vero DNA Control(30 ng/μL) | 25 μL | 50 μL |
【注】:适用机型(包含但不限于以下仪器):
Bio-Rad:CFX96 Optic ModμLe;
Thermo Scientific:ABI 7500;ABI QuantStudio 5;ABI StepOnePlus;
上海宏石医疗科技:SLAN-96S.
运输和保存方法
冰袋运输。-20℃储存,有效期2年。收到货后,建议将D组分Vero DNA Control储存于-80℃,其它组分储存于-20℃。
注意事项
1. 加样和配液步骤尽量都在冰上操作。
2. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。
3. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
4. 本产品仅作科研用途。
使用方法
一、Vero DNA Control的稀释和标准曲线的制备
用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer将Vero DNA Control进行梯度稀释,稀释浓度依次为 300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL
具体操作如下:
1. 将试剂盒中的Vero DNA Control和 DNA Dilution Buffer置于冰上融化,待*融化后,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。
2. 取7支干净的1.5 mL离心管,分别标记为 3 ng/μL,①,②,③,④,⑤,⑥。
3. 在标记为3 ng/μL的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL Vero DNA Control,即稀释为 3 ng/μL,振荡混匀后短时间快速离心10 sec,该浓度可分装置于-80℃短期保存(不超过3个月),使用时避免反复冻融。
4. 在①,②,③,④,⑤,⑥ 管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer,再进行梯度稀释,稀释方法如下:
稀释管 | 稀释比例 | 终浓度 |
① | 10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA Dilution Buffer | 300 pg/μL |
② | 10 μL ①+90 μL DNA Dilution Buffer | 30 pg/μL |
③ | 10 μL ②+90 μL DNA Dilution Buffer | 3 pg/μL |
④ | 10 μL ③+90 μL DNA Dilution Buffer | 300 fg/μL |
⑤ | 10 μL ④+90 μL DNA Dilution Buffer | 30 fg/μL |
⑥ | 10 μL ⑤+90 μL DNA Dilution Buffer | 3 fg/μL |
【注】:1. 每个浓度做3个复孔。该试剂可测试3 fg/μL-3 ng/μL线性范围,如需要,可扩大或缩小线性范围。
2. 为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-80℃。
3. 已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2-8℃ 7天,如长时间不用请放置于-20℃。
4. 为确保模板*混匀,每个梯度稀释时需震荡混匀1 min以上。
二、加样回收质控QC的制备
根据需要设QC中的Vero DNA加样浓度(以制备加3 pg/μL DNA量的样本QC为例),具体操作如下:
取100 μL待测样本加入1.5 mL干净的离心管中,再加入10 μL②,混匀,标记为加样回收QC。
加样回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备加样回收QC纯化液。
三、标准品回收质控QC的制备(可选)
根据需要设QC中的Vero DNA标准品浓度(以加3 pg/μL DNA 标准品为例),具体操作如下:
取100 μL 3 pg/μL定量参考品的稀释液加入1.5 mL干净的离心管中,标记为标准品回收QC。
标准品QC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备标准品QC纯化液。
四、阴性质控NC的制备
根据实验设置阴性质控,具体操作如下:
取100 μL样本基质溶液(或DNA Dilution Buffer)加入1.5 mL干净的离心管中,标记为阴性质控NC。
阴性质控NC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NC纯化液。
五、反应体系
组分 | 体积(μL) |
Vero qPCR mix | 16 |
Vero Primer&probe mix | 4 |
DNA template | 20 |
总体积 | 40 |
【注】:1. 根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量:qPCR MIX =(反应孔数+2)×40 μL(含有2孔的损失量)。实验中每一个样品模板最好重复做3个以上。
2. 加样完成密封好管子后,请先低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,*混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。
下图为参考板位:
该示例表示的是检测6个浓度梯度的DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、3个阴性质控NC、3个待测样本、3个加样回收QC和3个标准品回收QC。每个检测做3个重复孔。
六、扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)
创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。
创建1个检测探针,命名为Vero-DNA,选择报告荧光基团为FAM,猝灭荧光基团为none。
在Assign target (s) to the selected wells面板中,将标准曲线孔的Task一栏设置为Standard,并且在Quantity 一栏分别赋值为300000、30000、3000、300、30、3(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的sample name一栏中命名为300 pg/μL,30 pg/μL,3 pg/μL,300 fg/μL,30 fg/μL,3 fg/μL;将无模板对照NTC孔的Task一栏设置为NTC;将阴性质控NC孔、待测样本孔、样本QC孔的Task一栏设置为Unknown,并且在相应的Sample Name一栏中命名为NTC、NC、YP、QC,之后点击 。
4. 扩增程序设置:设置反应体积40 μL。
循环步骤 | 温度(℃) | 时间 | 循环数 |
预变性 | 95℃ | 10 min | 1 |
变性 | 95℃ | 15 sec | 40 |
退火/延伸(收集荧光) | 60℃ | 30 sec |
七、qPCR 结果分析
在 Analysis的Amplification Plot面板中,系统会自动给出Threshold,有时系统给出的Threshold离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节Threshold至合适位置,点击Analyze。此时可在Multicomponent Plot初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2. 在Analysis的Standard Curve面板中,可读取标准曲线的斜率(Slope)、截距(Intercept)、R²、扩增效率(Eff%)。正常的标曲,R²>0.99;90%≤Eff%≤110%。
3. 在Analysis的View well table面板中,Quantity一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本、样本ERC的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。
HB220322