Yeasen/翌圣生物 品牌
生产厂家厂商性质
上海市所在地
线粒体红色荧光探针
¥425D-盐(D-Luciferin Potassium Salt)
面议MycAway支原体去除试剂(1000×)
面议TUNEL细胞凋亡检测试剂(tunel试剂盒)
面议TUNEL细胞凋亡检测试剂盒
面议Human Fibronectin 人纤维连接蛋白
面议Collagenase IV胶原酶IV型
面议D- 盐(D-Luciferin, Sodium Salt)
¥748FITC标记鬼笔环肽(FITC Phalloidin)
¥785TRITC Phalloidin 罗丹明标记鬼笔环肽
¥785支原体喷雾剂(即用型)
面议1-Naphthylacetic acid 1-萘乙酸(α-萘乙酸,NAA),植物培养级别
面议Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行基因定量表达分析(如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等),无需提RNA,可直接进行qPCR表达分析,用时短,操作简单,出错率低,最短只需1.5 h就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为探针法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的细胞裂解模块,为补充试剂。
组分信息
组分编号 | 组分名称 | 16814ES40 | 16814ES60 |
16814-A | FCD Lysis Buffer | 2 mL | 5 mL |
16814-B | FCD Washing Buffer | 8 mL | 20 mL |
16814-C | FCD Stop Solution | 100 μL | 250 μL |
16814-D | DNase I | 80 μL | 200 μL |
储存条件
16814-A和 16814-B未开封时请置于-25~-15℃保存,融解后置于4℃保存,注意防止污染,其余组分长期保存时请于-25~-15℃保存,有效期1年。
使用说明
一、裂解产物的制备
将试剂放置室温下融化,使用前上下颠倒,轻轻混匀,并轻微离心后使用,避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
将细胞转移至离心管中*,5000 rpm离心2 min收集细胞**,充分吸除培养基。若贴壁细胞在96孔板中培养,可直接吸除培养基。
各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗细胞,5000 rpm离心2 min,吸尽FCD Washing Buffer。
各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase I溶液,室温吸打混匀后静置5 min,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右,即可得到裂解产物****,细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。
*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 102 - 1× 105 cells,若细胞数量较多,可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。
**不同细胞的离心条件不同,请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。
***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要,加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。
****细胞裂解产物溶液长期保存时,请置于-25~-15℃。
二、反转录
室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀,置于冰上并按下表配置反应体系:
组分 | 体积 (μL) | 终浓度 |
4× Hifair® FCD RT Mix | 5 | 1× |
裂解产物* | x | - |
RNase-free H2O | Up to 20 | - |
表1 反转录反应体系
*避免吸入细胞碎片,推荐使用量为2 μl,最大不超过反应体系的55%。
移液器轻轻混匀上述配制的反应液,按下表程序进行反转录反应**:
反应温度 | 反应时间 |
37℃ | 5 min |
85℃ | 5 sec |
表2 反转录反应程序
**反转录温度推荐使用37℃,反转录产物可直接进行下游qRT-PCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制,得到合适的Ct值(10-35),可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验,可放置于-25~-15℃保存。
三、荧光定量PCR
体系配置
使用下列组份比例配制反应液(配制过程请于冰上进行):
组分 | 体积(μL) | 终浓度 |
2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix | 12.5 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 200 nM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 200 nM |
Probe (10 μM) | 0.25-1 | 100-400 nM |
反转录产物* | x | - |
RNase-free H2O | Up to 25 | - |
表3 qPCR反应体系
*高浓度模板易导致非特异扩增,可适当将模板稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物探针浓度。
荧光定量PCR快速扩增程序(推荐)
本产品推荐使用快速程序扩增,可大大减少反应时间。使用Tm值较低的引物难以扩增时,可额外调整退火温度。
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 95℃ | 10 sec | 1 |
变性 | 95℃ | 5 sec | 45 |
退火/延伸** | 60℃ | 10 sec |
表4 qPCR反应程序(快速)
**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。
荧光定量PCR常规扩增程序
实验仪器不满足快速反应时间时,也可使用常规程序进行扩增。
循环步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 95℃ | 10 sec | 1 |
变性 | 95℃ | 15 sec | 40-45 |
退火/延伸** | 60℃ | 30 sec |
表5 qPCR反应程序(常规)
注意事项
使用前,将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
实验时,请尽量使用无污染的耗材,避免污染。
本产品避免反复冻融,配制时应避免强光照射。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
本产品仅作科研用途!