氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量检测试剂盒​说明书

  可见分光光度法 BC1180 ：50T/48S 试剂一：液体1瓶，50ml，4℃保存。 试剂二：液体1支，170μl，4℃保存。 试剂三：液体1瓶 60ml，4℃保存。
试剂四：液体1瓶 8ml，4℃保存。 试剂五：粉剂1支，4℃保存，用前8ml蒸馏水溶解。 试剂六：液体1支，40μl，用前0.8ml蒸馏水稀释。 标准品：粉剂1支，10mg，4℃避光保存。 氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽（GSH）的氧化形式，又称为二硫代谷胱甘肽，是两分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG会被谷胱甘肽还原酶还原成GSH，因此机体中大多数是以还原型形式存在。测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。本试剂盒利用谷胱甘肽能和5，5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5，5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸，2-硝基-5-巯基苯甲酸在波长412nm处具有光吸收的特点，通过2-乙烯吡啶抑制样品中原有的还原型谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽还原酶将GSSG还原为GSH，借此测定氧化型谷胱甘肽的含量。 分析天平、微量匀浆器（规格2ml）、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计、1ml比色皿。
一、 样品的处理
（1）组织处理 新鲜组织先用PBS冲洗2次，然后称取动物组织或者植物组织0.1g。加入用试剂一润洗过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入1ml试剂一（组织/试剂一比例保持不变即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；10000rpm 4℃离心10min；取上清液放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。 （2）血液处理 血浆：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的试剂一，4℃，8000g离心10分钟，将上清移入新的试管中放置于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。
血细胞：将收集的抗凝血于4℃，600g离心10分钟，弃去上层血浆用3倍体积的PBS清洗3次（用PBS重悬血细胞，600g离心10分钟），加入等体积试剂一，混匀后4℃放置10分钟，8000g离心10分钟，吸取上清放于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。 （3）细胞处理 收集不少于108个细胞，先用PBS清洗细胞2次（PBS重悬细胞，600g离心10分钟），加入3倍细胞沉淀体积的试剂一重悬细胞，反复冻融2-3次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解），8000g离心10分钟，收集上清于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10天）。

二、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量检测试剂盒实验操作：
1、分光光度计预热30min以上，调节波长412nm，蒸馏水调零。
2、试剂二放置37℃（哺乳动物）或25℃（一般物种）水浴中保温30min。
3、标准品的稀释：将标准品用1ml蒸馏水溶解(4℃保存)，浓度为10mg/ml。取适当溶液配制浓度为25μg/ml、20μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、0μg/ml的标准品（试剂一十倍稀释后进行稀释）。
4、取1.5ml离心管，加入100μL稀释好的标准品或样品，加入2μL试剂二，混匀后37℃孵育30分钟。
5、制作标准曲线
孵育完成后标准管依次加入700μL试剂三，100 μL试剂四，100 μL试剂五，10 μL试剂六，迅速混匀后，测定412nm处30 s和150 s光吸收A1和A2。吸光度（A2-A1）为横坐标（x），浓度为纵坐标（y）做标准曲线。
6、样品管依次加入700μL试剂三，100 μL试剂四，100 μL试剂五，10 μL试剂六，迅速混匀后，测定412nm处30 s和150 s光吸收A1和A2，△A= A2- A1。
三、氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量检测试剂盒GSSG含量计算 根据标准曲线，将样品△A带入公式中（x），计算出样品浓度y（μg/ml）。 （1）按蛋白浓度计算 GSSG（μg / mg prot）=y×V 反总÷V 样÷Cpr =y×10.12÷Cpr （2）按样本质量计算 GSSG（μg /g）= y×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)= y×10.12 ÷W （3）按细胞数量计算 GSSG（μg /104 cell）= y×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)= y×10.12 ÷细胞数量 （4）按液体体积计算 GSSG（μg / mL）= y×V 反总÷V 样= y×10 V 反总：反应总体积，1.012mL；V 样总：上清液总体积，1 mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1 mL；W：样品质量，g ；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL。
1、样品处理需匀浆*，若当天不能完成测量，可放-80℃保存。
2、若不确定样品中GSSG含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。
3、此方法利用酶促反应速率计算底物浓度，尽量准确在30秒和150秒处完成读数。
4、因为试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。