还原型谷胱甘肽(GSH)含量检测试（微量法）说明书

微量法
货号：BC1175
规格：100T/96S
产品内容：
试剂一：液体1 瓶，100mL，4℃保存。
试剂二：液体1 瓶，20 mL，4℃保存。
试剂三：液体1 瓶，8 mL，4℃避光保存。
标准品：粉剂1 支，10mg，4℃避光保存。
还原型谷胱甘肽(GSH)含量检测试（微量法）产品说明：
谷胱甘肽是由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含
巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-
二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯
甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为黄色产物，在波长412nm 处具有
光吸收。
自备仪器和用品：
分析天平、微量匀浆器（规格2ml）、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计或酶标
仪、超微量比色皿或96 孔板。
样品的处理
1、组织处理：
新鲜组织先用PBS 冲洗2 次，然后称取动物组织或者植物组织0.1g。加入用试剂一润洗过
的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入1ml 试剂一（组织/试剂一比例保持不变即可），
迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；8000rpm 4℃离心10min；取上清液放置于4℃待测，
若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10 天）。
2、血液处理
血浆：将收集的抗凝血于4℃，600g 离心10 分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体
积的试剂一，4℃，8000g 离心10 分钟，将上清移入新的试管中放置于4℃待测，若暂时不能完成
测试可放于-80℃保存（可保存10 天）。
血细胞：将收集的抗凝血于4℃，600g 离心10 分钟，弃去上层血浆用3 倍体积的PBS 清洗3
次（用PBS 重悬血细胞，600g 离心10 分钟），加入等体积试剂一，混匀后4℃放置10 分钟，8000g
离心10 分钟，吸取上清放于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10 天）。
3、细胞处理
收集不少于106 个细胞，先用PBS 清洗细胞2 次（PBS 重悬细胞，600g 离心10 分钟），加
入3 倍细胞沉淀体积的试剂一重悬细胞，反复冻融2-3 次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶解），
8000g 离心10 分钟，收集上清于4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存10 天）。
操作步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min 以上，分光光度计调节波长412nm，蒸馏水调零。
2、试剂二放置37℃（哺乳动物）或25℃（一般物种）水浴中保温30min。
3、空白管检测：取超微量比色皿，依次加入20μL 蒸馏水，140μL 试剂二，40μL 试剂三，混匀，
放置2min 后测定412nm 吸光度A1。
4、制作标准曲线
称1mg 标准品用1ml 蒸馏水溶解，浓度为1mg/ml。取适当溶液配制浓度为200μg/ml、100μg/ml、
50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml 的标准品（试剂一十倍稀释后进行稀释）。
取1.5mlEP 管依次加入20μL 标准品，140μL 试剂二，40μL 试剂三，每管混匀后静置2min，检
测412nm 处吸光度，吸光度减去空白孔（A1）为横坐标，根据吸光度（x）和浓度（y，μg/ml）做
出标准曲线。
5、样品管测定：取超微量比色皿，依次加入20μL 样品，140μL 试剂二，40μL 试剂三，混匀后静
置2min 检测412nm 处吸光度A2，△A= A2- A1。
6、酶标仪操作同分光光度计，操作尽量迅速。
GSH 含量计算
根据标准曲线，将样品△A 带入公式中（x），计算出样品浓度y（μg/ml）。
（1）按蛋白浓度计算
GSH（μg / mg prot）=y×V 反总÷V 样÷Cpr =y×10÷Cpr
（2）按样本质量计算
GSH（μg /g）= y×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)= y×10 ÷W
（3）按细胞数量计算
GSH（μg /10 4cell）= y×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)= y×10 ÷细胞数量
（4）按液体体积计算
GSH（μg / mL）= y×V 反总÷V 样= y×10
V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样总：上清液总体积，1 mL；V 样：加入反应体系中上清
液体积，20μL=0.02 mL；W：样品质量，g ；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项：
1、样品处理需匀浆*，若当天不能完成测量，可放-80℃保存。
2、标准品：还原型谷胱甘肽现配现用。
3、若不确定样品中GSH 含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。
4、因为试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。

相关文献:

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《MicroRNA-98 reduces amyloid β-protein production and improves oxidative stress and mitochondrial dysfunction through the Notch signaling pathway via HEY2 in Alzheimer's disease mice》 作者:Fang?Zhou Chen Ying Zhao Hui?Zhao Chen 期刊:International Journal of Molecular Medicine 影响因子:2.928 PMID:30365070
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