稳定重组HEK293细胞系，工程化设计用于多X环素诱导表达人类Nav1.7（Genbank #Q15858），在C末端融合绿色荧光蛋白[激发约395 nm，475 nm；发射约510 nm]，并带有C末端链球菌素结合肽（SBP）融合。Nav1.7是一种河T毒素敏感的电压门控钠通道IX亚型α亚基（SCN9A）。

Nav1.7是一种电压门控钠离子通道，由人类SCN9A基因编码。它通常在两种类型的神经元中高水平表达：背根神经节和三叉神经节的伤害感受神经元，以及交感神经节神经元，这些是自主（不自主）神经系统的一部分。

Nav1.7存在于痛觉感觉神经末梢，即伤害感受器附近，接近冲动发起区域。Nav1.7通道产生快速激活和失活的电流，对河T毒素水平敏感。缺乏伤害感受器中Nav1.7的敲除小鼠显示出对炎症性疼痛反应减少[1]。

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应用

? 药物化合物筛选

? 功能测定

细胞培养协议

细胞解冻

1. 在37°C水浴中摇晃装有冷冻细胞的小瓶大约60秒。细胞解冻后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速将小瓶的全部内容转移到含有10 ml预热的解冻培养基4（无Blasticidin或Zeocin）的试管中。在37°C水浴中放置细胞过久将导致活性迅速丧失。

2. 立即以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基并将细胞在5 ml预热的解冻培养基4（无Blasticidin或Zeocin）中重悬。

3. 将重悬的细胞转移到T25或T75培养瓶中，并在37°C、5% CO2培养箱中培养。

4. 培养24小时后，检查细胞附着和活性。更换培养基为新鲜的解冻培养基4（无Blasticidin或Zeocin），并继续在37°C、5% CO2培养箱中培养，直到细胞准备好传代。

5. 细胞应在w全融合前传代。在s次传代及后续传代中，使用生长培养基4A（含Blasticidin和Zeocin）。

细胞传代

1. 抽去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并用0.05% Y酶/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入生长培养基4A并转移到试管中。以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基并将细胞在不含Blasticidin和Zeocin的生长培养基4A中重悬。按照每周1:10至1:15的期望亚培养比例，将细胞种入新的培养容器中。

细胞冷冻

1. 抽去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并用0.05% Y酶/EDTA从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入生长培养基4A并计数细胞。

3. 以300 x g的速度离心细胞5分钟，去除培养基并将细胞在4°C冷冻培养基（BPS Bioscience #79796，或10% DMSO + 90% FBS）中重悬，细胞浓度约为2 x 10^6个细胞/ml。

4. 将1 ml的细胞悬浮液分装到冷冻小瓶中。将小瓶放入保温容器中缓慢冷却，并在-80°C下保存过夜。

5. 次日将小瓶转移到液氮中保存。

注意：建议在早期传代时扩增细胞并至少冷冻10个小瓶以备将来使用。

目标蛋白表达的诱导

为了表达Nav1.7，细胞在收获或测定前24小时用DMEM/F12 50/50补充10% FBS、1%青M素/链M素、1 ?g/ml多X环素（Biochemika #44577）和3 mM丁酸钠（Acros Organics #263190250）诱导。

图1. 表达Nav1.7的细胞的Western Blot。

使用抗钠通道Nav1.7，克隆N68/6（Millipore #MABN41）染色的HEK293 Nav1.7细胞的Western Blot，随后使用碱性磷酸酶偶联的抗小鼠IgG（Rockland Immunochemicals #610-1502）。M：分子量标记。

文献参考：

1. Catterall, W.A. Cell and Developmental Biology 16: 521–555 (2000).

2. Choi, J.S., et al. Neurology 67:1563-1567 (2006).

3. Li, Y., el al. Protein Science 20 (1): 140–149 (2011).

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Nav1.7-GFP HEK293细胞系Nav1.7-GFP HEK293细胞系