NF-κB TWO-Luciferase Reporter HEK293 Cell Line 是一种设计用于监测细胞活性以及 NF-κB（核因子 Kappa B）活性的 HEK293 细胞系。它包含一个由 NF-κB 响应元件驱动的萤火虫荧光素酶报告基因，该元件位于最小 TATA 启动子上游的四个拷贝。此外，这种细胞系在 CMV 启动子的控制下恒定表达 Renilla 荧光素酶，可用于确定细胞活性。这种细胞已经通过 TNFα（肿瘤坏死因子α）和抑制剂 IKK-16 二ys盐进行了验证。

背景

核因子 Kappa B (NF-κB)/Rel 蛋白包括 NF-κB2 p52/p100、NF-κB1 p50/p105、c-Rel、RelA/p65 和 RelB。这些蛋白作为二聚体转录因子，控制调节包括先天和适应性免疫、炎症、应激反应、B细胞发育和淋巴器官发生在内的广泛生物学过程的基因。它几乎存在于所有哺乳动物细胞中，并对细胞应激信号做出响应，如应激、自由基、紫外线辐射以及细菌和病毒。通过肿瘤坏死因子受体（TNFR）激活 NF-κB 是在与其相应的配体 TNFα（肿瘤坏死因子α）结合时发生的。NF-κB 的激活增强了细胞炎症并防止凋亡，这有助于肿瘤的发展。了解 NF-κB 通路及其调节方式对于理解健康和疾病中的基因调控至关重要。

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应用

? 监测 NF-kB 活性。

? 筛选 NF-kB 信号通路的激活剂或抑制剂。

? 并行研究化合物对 NF-kB 活性和细胞活性的影响。

细胞培养协议

注意：HEK293 细胞源自人类材料，因此建议采取适当的安全预防措施。

细胞解冻

1. 在 37°C 水浴中摇晃装有冷冻细胞的小瓶大约 60 秒。细胞解冻后（可能比 60 秒稍快或稍慢），迅速将小瓶的全部内容转移到含有 10 ml 预热的解冻培养基 1 的试管中。

注意：在 37°C 的水浴中放置细胞过久会导致活性迅速丧失。

2. 立即以 300 x g 的速度离心细胞 5 分钟，去除培养基并将细胞在 5 ml 预热的解冻培养基 1 中重悬。

3. 将重悬的细胞转移到 T25 或 T75 培养瓶中，并在 37°C、5% CO2 培养箱中培养。

4. 培养 24 小时后，检查细胞附着和活性。更换培养基为新鲜的解冻培养基 1，并继续在 37°C、5% CO2 培养箱中培养，直到细胞准备好传代。

5. 细胞应在W全融合前传代。在S次传代及后续传代中，使用生长培养基 1G。

细胞传代

1. 抽去培养基，用无 Ca2+/Mg2+ 的磷酸盐缓冲液 (PBS) 冲洗细胞，并用 0.05% Y酶/EDTA 从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入生长培养基 1G 并转移到试管中。以 300 x g 的速度离心细胞 5 分钟，去除培养基并将细胞在生长培养基 1G 中重悬。

3. 按照每周 1:5 到 1:10 的期望亚培养比例，将细胞种入新的培养容器中。

细胞冷冻

1. 抽去培养基，用无 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 冲洗细胞，并用 0.05% Y酶/EDTA 从培养容器中分离细胞。

2. 一旦细胞分离，加入生长培养基 1G 并计数细胞。

3. 以 300 x g 的速度离心细胞 5 分钟，去除培养基并将细胞在 4°C 的细胞冷冻培养基 (BPS Bioscience #79796) 中重悬，细胞浓度约为 2 x 10^6 个细胞/ml。

4. 将 1 ml 的细胞悬浮液分装到每个冷冻小瓶中。将小瓶放入保温容器中缓慢冷却，并在 -80°C 下保存过夜。

5. 次日将小瓶转移到液氮中长期保存。

注意：建议在早期传代时扩增细胞并至少冷冻 10 个小瓶以备将来使用。

图 1. 在 hTNFα 存在下，NF-κB TWO-Luciferase Reporter HEK293 Cell Line 荧光素酶活性的细胞滴定曲线。

细胞在 96 孔板中以不同密度过夜培养，随后在次日早晨用 hTNFα 处理。使用 TWO-Step Luciferase (Firefly & Renilla) 检测系统测量了萤火虫和 Renilla 荧光素酶活性。结果以背景减去的发光信号显示。

文献参考：

Chen W., et.al., 2011 Front. Biosci. 16: 1172-1185

Schmeck B., et.al., 2007 Eur. Respir. J. 29: 25-33

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NF-κB双荧光素酶报告基因HEK293细胞系NF-κB双荧光素酶报告基因HEK293细胞系