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微量法 100T/96S
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶,是谷胱-甘肽氧化还原循环的关键酶之一(通常昆虫中 GR 被 TrxR 取代)。GR 催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH,有助于维持体内 GSH/GSSG 比值。GR 在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用,此外 GR还参与抗坏血酸-谷胱-甘肽循环途径。
测定原理:
GR 能催化 NADPH 还原 GSSG 再生 GSH,同时 NADPH 脱氢生成 NADP+;NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰,相反 NADP+在该波长无吸收峰;通过测定 340 nm 吸光度下降速率来测定 NADPH 脱氢速率,从而计算 GR 活性。
自备仪器和用品:
低温离心机、水浴锅、移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、和蒸馏水
试剂组成和配置:
试剂一:液体 120mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×2 支,-20℃保存。临用前加入 1.2mL 蒸馏水,混匀。
试剂三:粉剂×2 支,-20℃保存。临用前加入 0.6mL 蒸馏水,混匀。
粗酶液提取:
组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。
细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 15min,取上清置于冰上待测。
血清等液体:直接测定。谷胱-甘肽还原酶(GR)测试盒