丙二醛（MDA）检测试剂盒     BB-4709

丙二醛（MDA）检测试剂盒

   使用方法：

• 样品处理

①血清、血浆、尿液、脑脊液样本：从待测样本中分理出的血清或血浆不应有溶血，直接检测，如超过线性范围，用生理盐水稀释后检测。

②组织、细胞等样本：组织或细胞可以使用PBS或贝博的Western及IP细胞裂解液等进行匀浆或裂解。匀浆或裂解组织时，组织重量占匀浆液或裂解液的比例应为10% 。匀浆或裂解等样品制备步骤宜在冰浴或4℃进行操作。样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的MDA含量。

1. 试剂配制：

TBA工作液的配制： 称取适量TBA，用TBA稀释液配制成浓度为0.68%的TBA工作液。TBA工作液需*溶解后再使用，可以加热到60－70℃促溶，并可通过反复剧烈Vortex促溶。配制好的TBA工作液4℃避光保存，至少3－4个月内有效。

1. MDA检测工作液的配制：临检测前，根据待测定的样品数(含对照)，参考下表新鲜配制适量的MDA检测工作液。

1.  稀释标准品：

取适量标准品用恰当溶液稀释至1、2、5、10、20、50μM(如果进行简易快速检测，标准品直接稀释10μM)。注意：待测样品为血清、血浆时，标准品宜用生理盐水稀释；待测样品由匀浆液、裂解液、PBS获得时，标准品宜用相同溶液稀释。其原则是保证空白管、标准管、测定管具有可比性。

1. 样品测定: 

离心管或其它适当容器内加入0.1ml匀浆液、裂解液、PBS、生理盐水等适当溶液作为空白对照(注意：待测样品为血清、血浆时，标准品宜用生理盐水稀释；待测样品由匀浆液、裂解液、PBS获得时，标准品宜用相同溶液稀释。加入0.1ml 上述不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入0.1ml样品用于测定；随后加入4.14mlMDA检测工作液。

在带盖试管中按下表配制检测反应体系：

1. 混匀, 加盖，95℃水浴煮沸40min，加热时务必注意避免液体暴沸溅出。如果使用加热块(Heat block)进行加热注意用重物压紧离心管盖；如果使用沸水浴，则需使用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管，或用Parafilm封住离心管口，用针头刺一小孔。zui方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热金属浴。
2. 水浴或流水冷却至室温。
3. 3500-4000rpm离心10分钟。
4. 取上清，蒸馏水调零，用分光光度计或酶标仪检测532nm或535nm处吸光值。如果用分光光度计，比色杯光径应为1cm，加入的上清量因根据比色杯的zui小量程而定；如果用酶标仪，96孔板每孔应加200μl上清液。如果不方便测定532nm或535nm的吸光度，也可以测定530-540nm之间的吸光度。

结果处理：

血清中MDA含量（umol/L）=（测定管吸光度-空白管吸光度）÷（标准管吸光度-空白管吸光度）×10 ×样品测试前稀释倍数

组织细胞中MDA含量（umol/mg）=（测定管吸光度-空白管吸光度）÷（标准管吸光度-空白管吸光度）× 10 ÷ 样品蛋白浓度（mg/ml）

参考取样量：

血清（浆）尿液取0.1ml；低密度脂蛋白悬液取0.1~0.2 ml。

食用油取0.03ml；细胞悬液细胞上清0.1~0.2 ml。

肝组织、心肌、肌肉组织等，取5%或10%匀浆0.1~0.2 ml较好。

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