超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒       BB-4710

超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒

使用方法：

1、 样品处理：

① 血浆或含红细胞的样品：从待测样品中分理出的血清或血浆不应有溶血，如果含有应去除红细胞后检测，如超过检测范围，用SOD检测缓冲液稀释后检测。

血清去除红细胞的简易方法如下：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。取至少500ul全血，4℃，3000g离心5min。转移上清至另一新的1ml离心管中，适量生理盐水稀释后待测。亦可采用红细胞裂解液去除红细胞。

②组织样本：动物用含有20U/ml heparin的生理盐水(0.9% NaCl containing 20U/ml heparin)灌流清除血液后获取组织样品。按照每100mg组织加入500ul SOD检测缓冲液的比例，用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆。4℃，4000g离心10min。取上清液（SOD粗提液）用于酶活性测定。

③细胞样本：对于贴壁细胞，由于后续用于酶活性的测定，避免使用胰酶消化细胞。可以使用细胞刮或EDTA处理细胞收集细胞。细胞用无菌的PBS或生理盐水洗涤1次。按照10⁶细胞加入300-500ul SOD检测缓冲液的比例，用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆，4℃ 10000g离心10min，取上清液（SOD粗提液）用于酶活性测定。

④上述样品准备完毕后可以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。通常10-20μg蛋白的细胞或组织匀浆液样品其中的SOD平均活力约1个活力单位左右(不同细胞和组织的差异会比较大，该活力范围仅作为初步的参考)。每种样品准备20-100ug蛋白量通常已经足够后续检测。

2、NBT/酶工作液的配制：按照每个反应1.6ml的体积，均匀混合1mlSOD检测缓冲液、0.3ml NBT显色液、0.3ml酶溶液，即可配置成1.6ml NBT/酶工作液，根据待检测样品(包括标准品)的数量，配置适量的NBT/酶工作液。

具体配置方法可以参考下表。配制好的NBT/酶工作液4℃或冰浴保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。     

注意: 由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后混匀后再使用。

3、 (可选做)准备SOD标准品：需自备SOD标准品，用本试剂盒提供的SOD检测缓冲液

将SOD标准品稀释至如下系列浓度：200U/ml，100U/ml，50U/ml，20U/ml，10U/ml，5U/ml，2U/ml。在随后的检测中可以各取20μl，参考样品进行检测。说明：为避免稀释后SOD酶活性的下降， SOD标准品宜现稀释现使用。

4、 参考下表使用小离心管或试管设置空白对照管、光照对照管、测定管。并按下表依次加

入待测样品和其它各种溶液，加入反应启动工作液后充分混匀。注意：加入反应启动工作液后反应即会开始，可以在低温操作或用排枪操作以减小各孔间因加入反应启动工作液的时间先后差异而导致的误差。     

5、 SOD活性检测：混匀，取空白对照管置于暗处，其他各管置于4000Lx日光下反应20min，

各管受光情况应*，温度高时时间缩短，低时延长。反应结束后，以不照光的空白对照管调零，用分光光度计或酶标仪检测560nm处吸光度值，如果用分光光度计，比色杯光径应为1cm，加入的上清量因根据比色杯的zui小量程而定。

计算：  

SOD活性单位活力单位的定义：以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位(U)。

液体中总SOD活力(U/ml)=(A_光照－A_测定)×V/(50%×A_光照×V_T)

组织、细胞匀浆液中总SOD活力(U/g)=( A_光照－A_测定)×V/(50%×A_光照×V_T×W)

组织、细胞匀浆液中总SOD活力(U/gHb)=( A_光照－A_测定)×V×C/(50%×A_光照×V_T×Hb)

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