NAD苹果酸酶(NADME)测试盒微量法

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商品属性：

测定意义：

ME广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和CO2，以及伴随NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
测定原理：
NAD-ME催化NAD+还原成NADH，在340nm下测定NADH增加速率。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存。；

试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量

（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，

加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

订购流程:

1、订购前,请与销售员核对产品中文名称/CAS号/英文名称等。

2、我司大部分产品都是现货,产品核实好下单后即可当天发货。(库存信息以当日为准)如有特殊要求请在发货前与销售员联系。

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4、质量保证,严格把关,如有产品异议经公司鉴定确认后可包换包退,免除客户后顾之忧。

5、我司提供完善的售后服务,使用过程中如有任何疑问,可提供技术指导。

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 检测工作液的配制：用时在试剂三中加入 15mL 试剂一和 1mL 蒸馏水，充分混匀待用；

用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、 测定前将检测工作液在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上。

4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、55μL 试剂二和 160μL 工作液，混匀

后立即记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

注意：如果 ΔA＜0.005，可将反应时间延长到 2 分钟或 5 分钟。

NAD-ME 活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T= 3617×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

NAD-ME（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T =3617×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T =7.234×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2.25×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：

比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：

反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

NAD-ME（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T= 7234×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

NAD-ME（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样÷V 样总×W) ÷T = 7234×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

NAD-ME（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样÷V 样总×500) ÷T =14.468×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2.25×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol；d：96孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：

反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量；500：细菌或细胞总数，500 万。

生化试剂盒的使用注意事项：

选择合适的试剂盒：根据实验目的和检测对象选择合适的试剂盒，确保实验的准确性和可靠性。

严格遵循说明书：按照试剂盒的说明书进行操作，避免误用或浪费。

注意保存条件：按照试剂盒的保存条件进行妥善保存，避免阳光直射、高温或潮湿等不利因素。

控制实验条件：在实验过程中严格控制实验条件，如温度、时间、pH值等，以确保实验结果的稳定性。

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