木质素过氧化物酶（Lip）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC1610

规格：50T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

产品说明：

木质素过氧化物酶（EC1.11.1.14）（Lip）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，是木质素的生物降解过程中的主要木质素降解酶类。Lip在饲料资源开发以及废水、废物处理领域有着广阔的应用前景。藜芦醇可以被Lip催化发生氧化反应，其产物藜芦醛在310nm处有最大吸收峰，以藜芦醇为反应底物，通过测定310nm处藜芦醛的吸光值，可以判定Lip的酶活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声波细胞破碎仪、研钵/匀浆器、1mL石英比色皿、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照样本质量（g）：试剂一体积（mL）为1:5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆；10000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2、细菌或细胞样本：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为 500~1000:1 的比例（建议500万细菌或细胞加入 1mL 试剂一）加入试剂一，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率300W，超声 3s，间隔 7s，总时间3min），10000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测。

3、培养液或其他液体：直接检测。若溶液浑浊则离心后取上清进行测定。

二、测定步骤

1、可见分光光度计预热30min以上，调节波长至310nm，蒸馏水调零。

2、测定前根据实验用量取出部分试剂一、试剂二、试剂三置于37℃预热10min以上。若一次性测定样本过多，可根据使用量将试剂一、二、三按6:2:1比例配成工作液后进行预热，测定时按照100μL样本+900μL工作液加入1mL石英比色皿进行测定。

3、加样表（在 1mL石英比色皿中依次加入下列试剂)：

    将上述试剂分别加入1mL石英比色皿后迅速吹打混匀，从加完最后一个试剂开始计时，记录第15s的吸光值A1，将混合液置于37℃水浴锅/恒温培养箱培养5min，取出测定5min15s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1，注意保证测定时间的准确性。

三、Lip活力的计算

1.按样本蛋白质浓度计算

酶活定义：37℃，pH4.5条件下，每mg组织蛋白每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。

Lip活性（U/mg prot）= ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷(V样×Cpr)÷T=215.05×ΔA÷Cpr

2.按样本质量计算

酶活定义：37℃，pH4.5条件下，每g组织每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。

Lip活性（U/g 质量）= ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷(V样÷V样总×W)÷T=215.05×ΔA÷W

3.按细菌/细胞数量计算

酶活定义：37℃，pH4.5条件下，每10⁴细菌/细胞每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。

Lip活性（U/10⁴ cell）= ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T=215.05×ΔA÷细胞数量

4、 按照样本体积计算

酶活定义：37℃，pH4.5条件下，每mL血清或液体样本每分钟氧化1nmol藜芦醇所需酶量为一个酶活单位。

Lip活性（U/mL）=ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷V样÷T=215.05×ΔA

ε：藜芦醛摩尔消光系数：9300L/mol/cm；d:比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.001L；V样：加入样本体积，0.1mL，V样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5 min；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

实验实例：

取0.09g杏鲍菇加入1mL试剂一进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清置冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算A1=0.228，A2=0.55，ΔA=A2-A1=0.322，按样本质量计算酶活得：

Lip活性（U/g 质量）=ΔA×V反总÷(ɛ×d)×10⁹÷V样÷T=672.95U/g 质量。

参考文献：

[1] Konadu K T, Harrison S, Osseo-Asare K. et al. Transformation of the carbonaceous matter in double refractory gold ore by crude lignin peroxidase released from the white-rot fungus[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2019, 143(1996):104735.

[2] Ahmed A A Q, Mckay T J M. Potential of Bacillus sp. LG7 as a Promising Source of Ligninolytic Enzymes for Industrial and Biotechnological Applications[J]. Proceedings of the National Academy of ences India, 2017.

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