谷*甘肽还原酶活性系数（GRAC）检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC6000

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入1.2mL蒸馏水，充分溶解，2-8℃可保存4周；

2. 试剂三：临用前取试剂三A加入0.537mL试剂三B，充分溶解，-20℃可分装保存4周，避免反复冻融；

3. 工作液：临用前根据样本量按照试剂一：试剂二：试剂三：试剂四= 80μL：20μL：8μL：20μL（128μL，1T）的比例配制工作液，现用现配；

4. 试剂五：临用前加入1.2mL蒸馏水，充分溶解，-20℃可分装保存4周，避免反复冻融；

5. 试剂五工作液：临用前根据样本量按照试剂五：蒸馏水=5μL：95μL（0.1mL，5T）的比例配制，现用现配。

产品说明：

谷*甘肽还原酶（Glutathione Reductase，GR）是广泛存在于真核与原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，该酶以核黄素衍生物核黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅基，催化NADPH还原氧化型谷*甘肽（G SSG）生成还原型谷*甘肽（GSH），维持巯基和膜蛋白处于还原状态。当生物体内缺乏核黄素时，FAD含量相应减少，GR活性也随之降低，谷*甘肽还原酶活性系数（GR Activation Coefficient，GRAC）迅速升高，出现唇炎、口角炎、结膜炎等临床症状。因此，GRAC用于核黄素营养状况评价，对于早期发现缺乏病患者采取防治措施具有重要意义。

GR催化NADPH还原G SSG，生成GSH，GSH与5，5’-二硫代-双-（2-*甲酸）（5，5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-*甲酸，2-硝基-5-*甲酸在波长412nm处有特征吸收峰，通过412nm处吸光度的变化可计算GR的活性。根据加入FAD前后GR活性的变化可计算得到GRAC。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、分析天平、水浴锅/恒温培养箱、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织样本：按质量（g）：试剂一体积（mL）=1：5~10比例加入试剂一（建议称取0.1g样本，加入1.0mL试剂一），冰浴匀浆后，于4℃，12000rpm离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

2. 细胞样本：按细胞数量（10⁴）：试剂一体积（mL）=500~1000：1的比例加入试剂一（建议500万细胞加入1.0mL试剂一），冰浴超声破碎细胞（功率200W，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后于4℃，12000rpm离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

3. 全血/红细胞：建议取10μL全血/红细胞，加入990μL试剂一，充分溶血混匀，于4℃，4000rpm离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

4. 血清/血浆等液体样本：直接测定。若有浑浊请离心后取上清置于冰上待测。

二、 测定步骤

1．可见分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。

2．将工作液37℃预热10min。

3．操作表：（在1.5mL EP管中加入下列试剂）

三、GRAC活性计算

GRAC=（A测定-A空白）÷（A对照-A空白）

注意事项：

1. 建议准备核黄素水平正常的样本进行检测，方便与核黄素缺乏的样本进行比较；如果没有核黄素水平正常的样本，可参考一般核黄素水平正常的样本GRAC为0.9-1.2；

2. 如果样本测定管吸光值大于1.5，建议将样本用试剂一稀释后进行测定；如果样本测定管吸光值接近空白管，可适当增大样本质量重新提取或提高加样表中样本体积，对照管、空白管蒸馏水需进行相应调整。

3. 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约0.11mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

实验实例：

1. 取0.1051g大鼠肾脏样本，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆，离心后取上清，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得：A测定=0.482，A对照=0.465，A空白=0.084，计算得：

GRAC=（A测定-A空白）÷（A对照-A空白）= 1.045。

2. 取10μL人红细胞，加入990μL试剂一，充分溶血混匀，离心后取上清，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得：A测定=0.530，A对照=0.529，A空白=0.084，计算得：

GRAC=（A测定-A空白）÷（A对照-A空白）= 1.002。

3. 取马血清样本，直接按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得：A测定=0.453，A对照=0.451，A空白=0.084，计算得：

GRAC=（A测定-A空白）÷（A对照-A空白）= 1.005。

参考文献：

[1] Sauberlich H E, Judd J H, Nichoalds G E, et al. Application of the erythrocyte glutathione reductase assay in evaluating riboflavin nutritional status in a high school student population [J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 1972, 25(8): 756-762.

[2] Gu CF, Chen YZ, Wang ZY. A study of the activation coefficients of blood glutathione reductase in the evaluation of experimental riboflavin deficiency [J]. Acta Nutrimenta Sinica, 1981, 3(4): 251-260.

[3] Ono S, Hirano H. FAD-induced in vitro activation of glutathione reductase in the lens of B2 deficient rats [J]. Current eye research, 1984, 3(4): 663-665.

[4] He J, Hu ML, H YM, et al. Study on the optimum conditions for determination of glutathione reductase activity coefficient in whole blood [J]. Chinese Journal of Public Health, 2002, 18(5): 615-616.

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