一氧化氮合成酶（NOS）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC5680

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 提取液二：为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃保存；

2. 试剂二：试剂放于瓶内玻璃瓶中，临用前取1瓶加入6mL缓冲液，-20℃分装可保存4周，避免反复冻融；

3. 试剂三工作液：临用前根据样本量按试剂三：缓冲液=4μL：396μL（400μL，5T）的比例配制，现用现配；

4. 试剂四：临用前取1支试剂四加入0.6mL缓冲液，-20℃分装可保存4周，避免反复冻融；

5. 试剂五：试剂放于瓶内玻璃瓶中，临用前取1支试剂五加入2.4mL缓冲液，-20℃分装可保存4周，避免反复冻融；

6. 工作液：临用前根据样本数量按照试剂一：试剂二：试剂三工作液：试剂四：试剂五=0.6mL：1.0mL：0.4mL：0.1mL：0.4mL（2.5mL，5T）的比例配制工作液，现用现配；

7. 试剂七工作液：临用前根据样本量按试剂七：缓冲液=10μL：450μL(0.46mL，约11T)的比例配制，现用现配；

8. 显色液：临用前根据样本数量按照显色液A液：显色液B液=1:1充分混匀，现配现用；

9. 标准品：10μmol/mL亚*酸钠。临用前取5μL 10μmol/mL亚*酸钠标准液，加入995μL蒸馏水，配制成0.05μmol/mL亚*酸钠标准液，现配现用。

注：试剂二、试剂四、试剂五为冻干试剂，可能存在肉眼观察试剂量相差较大甚至量很少的现象，此现象不影响使用，实际质量相同。

产品说明：

一氧化氮合成酶（Nitric Oxide Synthase，NOS，EC 1.14.13.39）是生物体内催化L-精*酸合成NO的一类酶，主要存在于血管平滑肌、巨噬细胞、内皮细胞、神经细胞、肝细胞、肾小球膜细胞等各种细胞中。NO作为细胞信息分子，在神经系统、免疫系统和心血管系统中起着重要的调节作用。

NOS催化L-精*酸、分子氧和NADPH，生成NO和NADP⁺，NO在水溶液中极易氧化生成NO₂^-和NO₃^-。在酸性条件下，NO₂^-与重氮盐磺酸胺生成重氮化合物，进一步与萘基乙烯基二胺偶合，产物在550nm处有特征吸收峰，测定其吸光值，可以计算得到NOS活性大小。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、分析天平、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织样本：建议称取0.2g样本，加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二，冰浴匀浆后，于4℃，12000g，离心15min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

2. 细菌/细胞样本：建议1000万细菌/细胞加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二，冰浴超声破碎（功率200W，超声3s，间隔7s，总时间5min），然后于4℃，12000g，离心15min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

3. 液体样本：直接测定。若液体有浑浊则离心取上清测定。

注：可根据样本量将提取液一和提取液二按照0.98mL：0.02mL的比例混匀后进行样本前处理。

二、 测定步骤

1．可见分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2．在2mL EP管按下表顺序加样：

三、NOS活性计算

1. 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NO定义为一个酶活单位。

NOS活性（U/mg prot）=（ΔA测定÷ΔA标准×C标准）×V样÷（Cpr×V样）×10³÷T×F=0.83×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr×F

2. 按样本质量计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol NO定义为一个酶活单位。

NOS活性（U/g 质量）=（ΔA测定÷ΔA标准×C标准）×V样÷（W×V样÷V样总）×10³÷T×F

=0.83×ΔA测定÷ΔA标准÷W×F

3. 按细菌/细胞数目计算

单位的定义：每10⁶个细菌/细胞每分钟催化产生1nmol NO定义为一个酶活单位。

NOS活性（U/10⁶ cell）=（ΔA测定÷ΔA标准×C标准）×V样÷（N×V样÷V样总）×10³÷T×F

=0.83×ΔA测定÷ΔA标准÷N×F

4. 按液体体积计算

单位的定义：每mL液体每分钟催化产生1nmol NO定义为一个酶活单位。

NOS活性（U/mL）=（ΔA测定÷ΔA标准×C标准）×V样÷V样×10³÷T×F=0.83×ΔA测定÷ΔA标准×F

C标准：0.05μmol/mL；V样：反应体系中加入的样本体积，0.24mL；V样总：加入的提取液一和提取液二的总体积，1mL；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞或细菌数目，以10⁶计；10³：单位换算系数，1μmol=10³nmol；T：反应时间，60min；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1. NOS稳定性差，易变性失活，建议使用新鲜样本实验，如果不立即进行实验，样本需-20℃保存。

2. 试剂二配制好后，建议根据样本量取出所需试剂二，剩余试剂二需尽快置于-20℃保存。

3. 如果∆A测定小于0.005或测定管吸光值接近空白管，可以增加样本量或者延长第一步37℃反应时间后再进行测定；如果∆A测定大于0.4，建议将样本匀浆后的上清液用缓冲液适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。

实验实例：

1. 取0.2075g新鲜小鼠脑组织样本，加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二进行冰浴匀浆，离心后取上清，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A测定-A空白=0.062-0.001=0.061，ΔA标准=A标准-A空白=0.386-0.001=0.385，按样本质量计算得：

NOS活性（U/g 质量）=0.83×ΔA测定÷ΔA标准÷W = 0.634 U/g 质量。

2. 取0.5×10⁶个细胞K562，加入0.98mL提取液一和0.02mL提取液二进行冰浴超声破碎，离心后取上清，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A测定-A空白=0.086-0.001=0.085，ΔA标准=A标准-A空白=0.386-0.001=0.385，按样本细胞数目计算得：

NOS活性（U/10⁶ cell）=0.83×ΔA测定÷ΔA标准÷N = 0.366 U/10⁶ cell。

3. 取240μL马血清样本，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算：ΔA测定=A测定-A空白=0.043-0.001 =0.042，ΔA标准=A标准-A空白=0.386-0.001=0.385，按液体体积计算得：

NOS活性（U/mL）=0.83×ΔA测定÷ΔA标准 = 0.091 U/mL。

参考文献：

[1] List BM, Klösch B, Völker C. et al. Characterization of bovine endothelial nitric oxide synthase as a homodimer with down-regulated uncoupled NADPH oxidase activity: tetrahydrobiopterin binding kinetics and role of haem in dimerization[J]. Biochemical Journal, 1997, 323(1): 159-165.

[2] Dawson J, Knowles RG. A microtiter-plate assay of nitric oxide synthase activity[J]. Molecular Biotechnology, 1999, 12(3): 275-279.

[3] Förstermann U, Sessa WC. Nitric oxide synthases: regulation and function[J]. European Heart Journal, 2012, 33(7): 829-837.

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