一氧化氮（NO）含量检测试剂盒说明书（酶法测定总NO）

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC1475

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前加入1.8 mL蒸馏水，-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

2、 试剂二：临用前加入1mL蒸馏水，-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

3、 试剂二工作液：临用前根据样本量按试剂二：蒸馏水=10μL：590μL（60T）的比例配制，当天用完；

4、 试剂三：临用前加入550μL蒸馏水溶解，-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

5、 试剂五：临用前根据样本数量按照试剂五：蒸馏水=5μL：225μL（23T）的比例配制试剂五溶液，现用现配；

6、 显色液：临用前根据样本数量按照显色液A液：显色液B液=1:1充分混匀，现配现用；

7、 澄清剂：临用前加入6mL蒸馏水，可震荡或50℃加热促进溶解。此溶液为饱和溶液，取上清使用即可。2-8℃可保存12周；

8、 标准液：10μmol/mL亚硝*。临用前取20μL 10μmol/mL标准液，加入380μL蒸馏水，配制成0.5μmol/mL标准液，再取0.5μmol/mL标准液50μL和蒸馏水450 μL混合配制成0.05μmol/mL标准溶液。

产品说明：

一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一种极不稳定的生物自由基，分子小，结构简单，常温下为气体，微溶于水，具有脂溶性，可快速透过生物膜扩散，作为一种新型的生物信使分子，在细胞间及细胞内发挥传递信号的作用。其广泛分布于生物体内各组织中，特别是神经组织中。在机体神经、循环、呼吸、消化、泌尿生殖等系统中也起着十分重要的作用。

NO在体内或水溶液中极易氧化生成NO₂^-和NO₃^-，本法利用硝酸还原酶特异性将NO₃^-还原成NO₂^-，在酸性条件下，NO₂^-与重氮盐磺酸胺生成重氮化合物，进一步与萘基乙烯基二胺偶合，产物在550nm处有特征吸收峰，测定其吸光值，可以计算NO含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、分析天平、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织样本：按质量（g）: 提取液体积（mL）1 : 5~10比例加入提取液（建议称取0.2g样本，加入1.0mL提取液），冰浴匀浆后，于4℃，12000rpm，离心15min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

2. 细菌/细胞样本：按细菌/细胞数量（10⁴）：提取液体积（mL）500~1000 : 1的比例加入提取液（建议1000万细菌/细胞加入1.0mL提取液），冰浴超声破碎细菌/细胞（功率200w，超声3s，间隔7s，总时间5min），然后于4℃，12000rpm，离心15min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

3. 液体样本：直接测定。若液体有浑浊则离心取上清测定。

二、测定步骤

1．可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，分光光度计蒸馏水调零。

2．操作表：

三、NO含量计算

1. 按样本蛋白浓度计算

NO含量（μmol/mg prot）= ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V样÷(V样×Cpr) = 0.05×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

2. 按样本质量计算

NO含量（μmol/g 质量）= ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V样÷(W×V样÷V样总) = 0.05×ΔA测定÷ΔA标准÷W

3. 按细菌/细胞数量计算

NO含量（μmol/10⁴ cell）=ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V样÷(V样×N÷V样总) = 0.05×ΔA测定÷ΔA标准÷N

4. 按液体体积计算

NO含量（μmol/mL）= ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V样÷V样= 0.05×ΔA测定÷ΔA标准

C标：标准管浓度，0.05μmol/mL；V样：加入样本体积，0.06mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g ；N：细菌/细胞总数，以10⁴计。

注意事项：

1、 如果样本匀浆液离心后上清仍旧浑浊，可直接进行反应，反应后在200μL反应液中加入50μL澄清剂，混匀后静置5min，离心后取200μL上清测定，这种情况下需将空白管和标准管进行相同处理。

2、 如果∆A测定小于0.005或测定管吸光值接近空白管，可以增加样本量后再进行测定；如果∆A测定大于0.6，建议将样本上清用提取液适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。

3、 如果样本上清有颜色（在550nm下有吸收峰），则需要补测样本的对照管，即将显色液用相同体积的蒸馏水代替。在550 nm下测定吸光值A，分别记为 A标准、A测定、A空白、A对照，计算ΔA标准=A标准-A空白，ΔA测定=A测定-A对照。此时试剂盒规格为100T/48S。

实验实例：

1. 取0.107g玉兰叶片样本，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，离心后取上清，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA测定=A测定-A空白=0.172-0.045=0.127，ΔA标准=A标准-A空白=0.526-0.045=0.481，按样本质量计算得：

NO含量（μmol/g 质量）=0.05×ΔA测定÷ΔA标准÷W = 0.05×0.127÷0.481÷0.107=0.123 μmol/g 质量。

2. 取0.0868g小鼠心脏样本，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，离心后取上清，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA测定=A测定-A空白=0.187-0.045=0.142，ΔA标准=A标准-A空白=0.526-0.045=0.481，按样本质量计算得：

NO含量（μmol/g 质量）=0.05×ΔA测定÷ΔA标准÷W = 0.05×0.142÷0.481÷0.0868=0.170 μmol/g 质量。

3. 取60μL牛血清样本，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA测定=A测定-A空白=0.326-0.045=0.281，ΔA标准=A标准-A空白=0.526-0.045=0.481，按液体体积计算得：

NO含量（μmol/mL）=0.05×ΔA测定÷ΔA标准 = 0.05×0.281÷0.481=0.029 μmol/mL。

相关发表文献：

[1] Peng X, Zhu L, Guo J, et al. Enhancing biocompatibility and neuronal anti-inflammatory activity of polymyxin B through conjugation with gellan gum[J]. International journal of biological macromolecules, 2020, 147: 734-740.

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